與CVB3 3A相互作用的人心臟蛋白的篩選及功能初探.pdf

1、目的：
　　運用酵母雙雜交技術，從人心臟 cDNA文庫中篩選與 CVB3非結構蛋白3A相互作用的人細胞蛋白；選取陽性蛋白之一的TMED4進行研究，探討CVB33A與TMED4的相互作用及其生物學意義，為進一步研究CVB3的致病機制及治療CVB3引起的相關疾病提供新的方向和依據(jù)。
　　方法：
　　1.以病毒RNA為模板，逆轉錄合成cDNA，再經PCR擴增出3A基因，并將其重組至真核表達質粒pGBKT7中，構建誘餌質粒pG

2、BKT7-3A；
　　2.采用乙酸鋰法將誘餌質粒pGBKT7-3A轉化至酵母菌AH109中；
　　3.Western Blot檢測融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[pGBKT7-3A]中的表達；
　　4. SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及X-α-Gal實驗檢測3A對報告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉錄自激活作用，小規(guī)模配合實驗檢測酵母菌的配合功能；

3、r>　　5.大規(guī)模配合篩選與3A蛋白相互作用的人細胞蛋白；
　　6.采用表型鑒定、PCR擴增和Alu I酶切等實驗方法對篩選所得陽性候選克隆進行歸類、測序及同源性比對分析；
　　7. SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的鑒定方法及X-α-Gal實驗檢測篩選所得陽性質粒 pGADT7-ADx對報告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉錄自激活作用，利用回返配合實驗初步驗證3A蛋白與各陽性蛋白的相

4、互作用；
　　8.質粒pBudCE4.1-3A轉染HeLa細胞36 h后，采用免疫熒光雙標技術，用Alexa Flour488山羊抗兔二抗（綠色熒光）與兔抗TMED4的特異性結合來標記 TMED4在細胞內的定位，用Rhodamine山羊抗鼠二抗（紅色熒光）與鼠抗His-Tag的特異性結合來標記3A在細胞中的定位，利用高內涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察3A蛋白與TMED4在細胞內的共定位情況，同時設立正常細胞作為陰性對照；
　　9.質

5、粒pBudCE4.1-3A轉染HeLa細胞48 h后，收集細胞蛋白裂解液，分別采用anti-TMED4或 anti-His-Tag進行細胞內免疫共沉淀，進一步驗證3A蛋白與陽性蛋白TMED4之間的相互作用；
　　10.收集質粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉染后24 h、36 h、48 h各時間點細胞，加入 CCK-8溶液后酶標儀檢測波長490 nm處各樣品 OD值，采用SPSS13.0軟件對結果進行分析；
　

6、　11.收集質粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉染后24 h、36 h、48 h各時間點細胞，使用Annexin V試劑盒對早期凋亡細胞進行染色后，高內涵細胞成像分析系統(tǒng)對早期凋亡細胞進行計數(shù)分析；
　　12.質粒pBudCE4.1-3A對細胞周期的影響：以G1/S期為切入點，收集質粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉染后24 h、36 h、48 h、54 h各時間點的細胞，應用流式細胞儀檢測細胞周期的變

7、化；
　　13.用質粒pBudCE4.1-3A轉染HeLa細胞18 h、24 h、36 h、40 h、48 h、54 h、60 h，采用MOI=5的CVB3感染HeLa細胞3h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h，收集各時間點細胞蛋白裂解液，同時設立正常細胞和空質粒轉染組細胞為對照，Western Blot檢測細胞內TMED4的表達情況。
　　結果：
　　1.雙酶切鑒定及測序結果提示3A已成功重組至 pGBK

8、T7載體的多克隆位點，且閱讀框與病毒3A基因一致；
　　2.表型鑒定和PCR法驗證重組誘餌質粒pGBKT7-3A已成功轉入酵母菌AH109中；
　　3.3A能在酵母菌AH109[pGBKT7-3A]中表達并且對酵母菌無毒性作用；
　　4. SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示3A對報告基因無轉錄自激活作用，小規(guī)模配合實驗表明3A蛋白在AH109中的表達

9、不影響酵母菌的配合功能；
　　5.以CVB33A為誘餌，經大規(guī)模配合實驗，從人心臟cDNA文庫中篩選得到52個陽性候選克??；
　　6.五十二個陽性候選克隆經Alu I酶切分析后可歸為6類，通過測序和同源性比對，共獲得6種不同類別的陽性蛋白：蘭尼堿受體2（Ryanodine Receptor2,RyR2），信號肽酶2（Signal peptidase complex subunit2,SPCS2），跨膜蛋白emp24（Tran

10、smembrane emp24 protein transport domain containing4,TMED4），細胞色素c氧化酶亞基I（Cytochrome c oxidase subunit I,COX1），細胞色素c氧化酶亞基III（Cytochrome c oxidase subunit III,COX3）和肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain,MYH7）/琥珀酸脫氫酶亞基D（Succinate dehydr

11、ogenase complex subunit D,SDHD）；
　　7. SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示6種陽性蛋白對報告基因無轉錄自激活作用，回返配合實驗初步驗證6種陽性蛋白與3A蛋白存在相互作用；
　　8.高內涵細胞成像分析系統(tǒng)顯示宿主蛋白TMED4主要在胞漿中表達，而病毒蛋白3A主要表達在胞漿核周區(qū)域，提示3A與TMED4在細胞胞漿內存在共定位

12、現(xiàn)象；
　　9.在質粒pBudCE4.1-3A轉染后的細胞中，3A蛋白能夠被anti-TMED4抗體共沉淀，而 TMED4也能夠被 anti-His-tag抗體共沉淀。細胞內免疫共沉淀結果提示：在質粒 pBudCE4.1-3A轉染后的細胞內，3A與 TMED4能夠發(fā)生相互作用；
　　10. CCK-8法結果提示：質粒pBudCE4.1-3A轉染細胞后36 h時間點細胞活性與空質粒轉染組相比明顯下降，且差異具有統(tǒng)計學意義，而轉

13、染24 h和48 h時間點的細胞活性與空質粒轉染組相比無明顯差異；
　　11.高內涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察早期凋亡細胞：質粒轉染后36 h，3A轉染組凋亡細胞數(shù)較空質粒轉染組有明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義，而轉染24 h和48 h時間點兩組細胞并無明顯差異；
　　12.流式細胞儀檢測結果顯示：轉染3A的細胞組 G1期細胞比例一直高于轉染空質粒的對照組，54 h細胞組G1期細胞比例差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而S期、G

14、2期的細胞比例沒有明顯變化。
　　13.收集質粒轉染和活病毒感染各時間點細胞蛋白裂解液，Western Blot檢測結果：3A轉染細胞后，細胞內的TMED4表達量逐漸下降，于轉染36 h時間點達到最低，隨后開始回升，至60 h后維持穩(wěn)定；空質粒轉染對照組細胞內TMED4表達量未發(fā)現(xiàn)明顯改變；CVB3活病毒感染細胞后細胞內 TMED4的表達逐漸下降，于感染9 h時間點達到最低，隨后開始回升，正常細胞對照組TMED4表達量無明顯改變。