金屬硫蛋白-3（MT-3）相互作用蛋白的分子克隆、鑒定及性質研究——探索金屬硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子機制.pdf

1、Alzheimer's病最顯著的神經病理特征是神經突形成以淀粉樣蛋白為核心的老年斑,由雙股螺旋微絲構成的神經元纖維纏結以及大量的神經元喪失,盡管目前還無法確定AD的病因,許多證據已經表明,MT-3(又叫神經生長抑制因子,GIF)含量下降是造成AD腦大量神經元喪失的主要因素.MT-3主要分布于腦部中樞神經系統(tǒng),在Alzheimer's癥腦提取物的存在下,對培養(yǎng)的神經元細胞具有特異的生長抑制活性.值得注意的是,單獨的MT-3或單獨的腦提取物

2、均不具有生長抑制活性,這表明,MT-3可能是與腦提取物中的其它因子協(xié)同作用而發(fā)揮其抑制功能的.迄今,對于MT-3對AD的作用機理,首次利用酵母雙雜交系統(tǒng)(又稱相互作用陷阱)在正常人腦cDNA文庫中對GIF相互作用蛋白進行了快速篩選,并通過GST融合表達系統(tǒng)對篩選到的GIFIP基因進行了表達,再從蛋白質的水平上進一步分析,確證表達產物與MT-3的相互作用及細胞生物學協(xié)同活性.為了進一步證實dUTPase與MT-3相互作用的真實性和特異性,

3、通過免疫共沉淀實驗來驗證它們在哺乳動物細胞293中的相互作用.將MT-3克隆于帶Flag標簽的真核表達載體pFlag-CMV-2,獲得能表達Flag-MT-3的真核表達質粒MT-3/pFlag-CMV-2.將細胞核dUTPase cDNA克隆于帶HA標簽的真核表達載體pSV-HA中,獲得表達HA-dUTPase融合蛋白的真核重組表達質料dUTPase/pSV-HA.使用Lipofectamine將MT-3/pFlag-CMV-2和dUT

4、Pase/pSV-HA共同轉染293細胞,并以MT-1/pFlag-CMV-2和dUTPase/pSV-HA共同轉染293細胞為對照,結果表明dUTPase可在哺乳動物細胞內與MT-1不發(fā)生相互作用,可與MT-3特異性結合.為了將來研究MT-3及其相互作用蛋白性質和功能的需要,鑒于蛋白單抗制備的困難,以大耳家兔為免疫動物,對MT-3及其相互作用蛋白的多抗進行了制備,進一步利用硫酸鹽沉淀法分離純化多抗IgG,通過一定的測定方法和相關研究實