PRB與PIAS3的相互作用及其功能研究.pdf

1、孕激素是一種甾體類(lèi)激素，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖功能中發(fā)揮重要作用(1)。孕激素功能的發(fā)揮主要通過(guò)激素與細(xì)胞內(nèi)特異的孕激素受體相互作用而產(chǎn)生，而孕激素受體PR主要有兩種亞型，即孕激素受體PRA和PRB。孕激素受體是一個(gè)結(jié)構(gòu)相似基因家族-核受體亞家族的成員，這個(gè)家族的蛋白都是配基激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(2)。孕激素受體這兩種亞型的不同主要在于PRB在其N(xiāo)端的BUS區(qū)包含一段164個(gè)氨基酸的AF3區(qū)。一般來(lái)說(shuō)，PRB存在于細(xì)胞漿中，在孕激素作用下，PRB會(huì)

2、進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性(3)。 PR和其他核受體的轉(zhuǎn)錄活性與蛋白的轉(zhuǎn)錄后共價(jià)修飾有關(guān)，它會(huì)影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。這些修飾包括蛋白質(zhì)的磷酸化(4)、乙酰化(5)、泛素化(6)和SUMO化(7)。其中SUMO化與共價(jià)結(jié)合SUMO(smallubiquitin-likemodifierprotein)蛋白有關(guān)。一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，比如GR、AR、P53、c-Jun和c-Myc都與SUMO-1共價(jià)結(jié)合。與泛

3、素化一樣，SUMO化有一組激活酶-E1、E2、E3酶，SUMO化修飾會(huì)引起蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、穩(wěn)定性或者是基因的轉(zhuǎn)錄活性的改變(8)。 本文結(jié)果顯示，我們?cè)谟眉す鈷呙韫簿劢癸@微鏡(LSCM)觀察PRB的亞細(xì)胞定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，在PIAS3的存在下，即使加入孕激素，也有大部分PRB并不進(jìn)入細(xì)胞核。這提示在PRB與PIAS3之間可能存在某種功能上的相互作用。因此，我們?cè)谌伺咛ツI細(xì)胞293T中建立了一套PRB轉(zhuǎn)錄激活熒光報(bào)告測(cè)試系統(tǒng)，檢測(cè)到P

4、IAS3對(duì)PRB轉(zhuǎn)錄激活活性有很強(qiáng)的抑制作用，并且這種抑制作用是孕激素依賴(lài)的。為了驗(yàn)證PRB與PIAS3之間是否可以相互結(jié)合，我們將PRB與PIAS3構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上。實(shí)驗(yàn)證明PRB與PIAS3在酵母細(xì)胞中可以相互結(jié)合，并且我們找出PRB與PIAS3相互作用的區(qū)域主要是PRB的DBD結(jié)構(gòu)域。 為進(jìn)一步確認(rèn)PRB與PIAS3之間存在特異性的蛋白質(zhì)相互作用，本文進(jìn)行了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(invitro：GSTpull-down)和體內(nèi)

5、結(jié)合實(shí)驗(yàn)(invivo：IP)，并獲得了與酵母中的發(fā)現(xiàn)相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除此之外，本文還應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，在活細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了PRB和PIAS3存在特異性地相互作用。PRB的SUMO化會(huì)抑制其轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)PIAS蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)大多可以作為一些細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的SUMO化E3酶，由此我們推測(cè)PIAS3對(duì)PRB轉(zhuǎn)錄活性的抑制與PRB的SUMO化有關(guān)。PRB存在多個(gè)SUMO化位點(diǎn)，其中第388個(gè)氨基酸是已經(jīng)證實(shí)的SUMO化主要修飾位