CVB3 VP1基因真核質粒的構建、表達及對細胞的影響.pdf

1、目的：
　　 構建柯薩奇病毒(CVB3)結構蛋白VP1基因的真核質粒pBudCE4.1-VP1，并檢測其在HeLa細胞中的表達，研究VP1蛋白對HeLa細胞形態(tài)、活性及細胞周期等方面的影響，為探討CVB3的分子致病機制奠定基礎。
　　 方法：
　　 1.質粒pBudCE4.1-VP1構建：抽提CVB3感染的HeLa細胞的總mRNA，RT-PCR擴增VP1基因，經(jīng)KpnⅠ和BgⅢ雙酶切后，克隆于真核載體pBudCE

2、4.1中，酶切鑒定后進行DNA測序驗證；
　　 2.質粒pBudCE4.1-VP1表達：將質粒pBudCE4.1-VP1轉染HeLa細胞，采用Western blotting和間接免疫熒光技術檢測VP1蛋白在HeLa細胞中的表達；
　　 3.質粒pBudCE4.1-VP1對細胞形態(tài)和活性的影響：質粒轉染HeLa細胞后，倒置顯微鏡連續(xù)觀察VP1蛋白對細胞形態(tài)的影響，通過MTT法檢測HeLa細胞的活性變化；
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3、.質粒pBudCE4.1-VP1對高爾基體的影響：采用免疫熒光雙標技術分析質粒VP1蛋白對細胞高爾基體基質蛋白GM130結構的影響；
　　 5.質粒pBudCE4.1-VP1對細胞周期的影響：以G1/S期為切入點，應用流式細胞儀檢測VP1轉染后16 h、20 h、24 h、28 h、32 h等時間點細胞周期的變化。
　　 結果：
　　 1.限制性內切酶酶切和測序結果表明VP1已成功插入pBudCE4.1載體的多克

4、隆位點，其基因序列與CVB3m株(GI：323432)VP1基因序列完全一致。
　　 2.Western blotting和免疫熒光技術結果顯示：質粒pBudCE4.1-VP1轉染HeLa細胞后能檢測到VP1蛋白的表達，且表達量隨轉染時間的延長而增加；
　　 3.質粒pBudCE4.1-VP1轉染HeLa細胞后12 h，部分細胞開始變圓；隨著轉染時間的延長，細胞出現(xiàn)較為明顯的病變效應，到轉染48 h、60 h后，幾乎未見

5、正常細胞。MTT法結果顯示：質粒VP1轉染的細胞與對照組細胞相比，OD值明顯降低(P<0.05)，且轉染時間越長，細胞活性越差；
　　 4.免疫熒光技術分析結果顯示：質粒pBudCE4.1-VP1轉染HeLa細胞后，隨VP1蛋白表達量的增加，細胞蛋白GM130綠色熒光由帶狀分布趨于彌散，呈散在分布，且熒光強度減弱；
　　 5.細胞周期結果顯示：質粒pBudCE4.1-VP1轉染HeLa細胞16 h、20 h、24 h、2

6、8 h、32 h后，與空質粒轉染對照組G1期細胞相比，VP1轉染組G1期細胞分別升高到：58.81％(P<0.05)，57.15%(P<0.05)，54.87%(P<0.01)，55.46%(P<0.05)，56.96%(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.成功構建CVB3 VP1基因真核表達質粒pBudCE4.1-VP1，并能在HeLa細胞中表達；
　　 2.VP1蛋白作用于HeLa細胞后可引起明顯的細胞