人MKRN1基因shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其對(duì)HEK293細(xì)胞特性的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建人MKRN1基因shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)其對(duì)HEK293細(xì)胞MKRN1基因表達(dá)及細(xì)胞特性的影響，為進(jìn)一步研究MKRN1基因的功能奠定基礎(chǔ)。 方法:本課題設(shè)計(jì)并合成特異性針對(duì)MKRN1基因的小干擾片段，定向克隆到帶有卡那霉素抗性和綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pGenesil-1中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及DNA序列測(cè)定。用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，觀察其對(duì)細(xì)胞MKRN1基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的

2、影響。選取最有效干擾序列，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期分布。同時(shí)觀察最有效干擾序列對(duì)細(xì)胞hTERT基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果:通過(guò)酶切鑒定和序列測(cè)定，成功構(gòu)建三條表達(dá)短發(fā)夾RNA的質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，三條sbRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在mRNA水平對(duì)MKRN1抑制率分別為52.4％、26.2％、42.9％；在蛋白水平對(duì)MKRN1抑制率分別為69.

3、1％、27.9％、50.0％。 與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-MKRN1-shRNAhk和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，MTT檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-1-MKRN1-shRNA1能明顯促進(jìn)HEK293細(xì)胞的增殖。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-1-MKRN1-shRNA1組G2期和S期細(xì)胞增多，表明pGenesil-1-MKRN1-shRNA1可以促進(jìn)HEK293增殖。RT-PCR、Western blot檢