精子凋亡與男性不育相關系列研究.pdf

1、第一部分檢測人類精子的兩種早期凋亡改變及其與常規(guī)精液指標和精子核DNA完整性的關系 目的：檢測人類射出精液中的兩種早期凋亡標志(磷脂酰絲氨酸的外顯和線粒體膜電位)可否成為檢測精子質量的良好指標。 方法：以56位到生殖中心男科進行常規(guī)精液檢查的患者的精液樣本為研究對象。常規(guī)檢測精液的密度、活動力和畸形率。同時，對于這些精液樣本采用Annexin-V/PI雙染的方法檢測精子細胞膜的磷脂酰絲氨酸(PS)的外顯情況。采用JC-1

2、(5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenimidaz01yl carbocyanine iodide)染色的方法檢測精子的線粒體膜電位(MMP)的情況。采用末端轉移酶介的dUTP末端標記法(TUNEL)檢測精子核DNA的完整性。分別將精子的兩種早期凋亡改變(PS外顯和MMP改變)與常規(guī)精液分析指標(包括：密度、活動力和畸形率)和精子核DNA完整性(TUNEL)進行相關性分析。

3、結果：研究顯示：通過Annexin-V/PI染色，精子群體可被分為4個亞群：無PS外顯的活精子，即‘AN-/PI-’精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染時，熒光顯微鏡下觀察整個精子無熒光；有PS外顯的活精子，‘AN+/PI-’精子，即，早期凋亡的精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染熒光顯微鏡下觀察整個精子呈現(xiàn)綠色熒光；有PS外顯的死精子，‘AN+/PI+’精子，即，晚期凋亡的精子，該亞群精子在Annexin-V/PI

4、雙染時在熒光顯微鏡下觀察精子頭部細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，而細胞核呈現(xiàn)紅色熒光；無PS外顯的死精子，即‘AN-/PI+’精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染時，在熒光顯微鏡下觀察，精子頭部呈現(xiàn)紅色熒光。本研究通過流式細胞儀檢測各精子亞群在精子群體中所占比率如下：‘AN-/PI-’精子占55±16﹪；‘AN-/PI+’精子占10±6﹪；‘AN+/PI+’精子占23±10﹪；AN-/PI+精子占11±7﹪。通過JC-1染色，線粒體膜電位

5、高的精子在熒光顯微鏡下，在精子體部線粒體鞘部位呈現(xiàn)紅色熒光，而線粒體膜電位低的精子在熒光顯微鏡下，精子體部線粒體鞘部位呈現(xiàn)綠色熒光。研究通過流式細胞儀檢測本研究群體的精子線粒體膜電位為：55±22﹪。通過TNEL方法檢測精子的核DNA完整性，通過流式細胞儀檢測顯示本研究群體的精子TUNEL(+)率為：23±14﹪。本研究顯示：‘AN+/PI+’精子比率與精子的密度、活動力和正常形態(tài)率呈負相關關系。TUNEL(+)精子比率與精子的密度、活

6、動力和正常形態(tài)率呈負相關關系。相反，‘AN+/PI-’精子的比率與精子的密度和正常形態(tài)率不存在相關關系。但是，‘AN+/PI-’精子的比率與精子的活動力呈負相關關系?！瓵N-/PI-’精子的比率與精子的密度、活動力和正常形態(tài)率呈正相關關系。精子的MMP和精子的密度、活動力和正常形態(tài)率呈正相關關系。 當我們把精子的兩種早期凋亡改變(PS外顯和MMP改變)與精子TUNEL檢測結果進行相關分析時發(fā)現(xiàn)：‘AN+/PI+’精子和‘AN-/

7、PI+’精子的比率與精子的TUNEL，(+)率呈現(xiàn)正相關關系。而‘AN-/PI-’精子比率和精子的MMP與精子的TUNEL，(+)率呈現(xiàn)負相關關系。另外，‘AN-/PI-’精子的比率與精子的MMP成正相關關系?！瓵N+/PI+’精子和‘AN+/PI-’精子的比率與精子的MMP呈現(xiàn)負相關關系。 結論：雖然早期凋亡(AN+/PI-’)精子的比率只與精子的活動力有相關關系。我們研究顯示：精液中各精子亞群的比率(Annexin-V/PI

8、雙染色)，尤其是‘AN-/PI-’精子的比率，和MMP的降低可以作為診斷男性不育的良好的指標。它們可以為預測IVF的結局提供一些重要的信息。 目的：研究對比精液質量差的不育病人的精液和有生育能力的志愿者的精液經過常規(guī)梯度密度離心(DGC)方法處理后的精子的磷脂酰絲氨酸(PS)的外顯、線粒體膜電位(MMP)和核DNA完整性_的情況。其次，評價一種結合DGC和磁性篩選(MACS)技術的新型精液處理方法對于不育病人精子群體的活動力、P

9、S外顯、MMP和核DNA完整性的影響。 方法：本研究選取15例在生殖醫(yī)學中心男科門診就診的男性不育患者的精液樣本作為研究對象，另外選取10位確認有生育能力的志愿者的精液樣本作為正常對照。本研究納入標準是：所有不育夫婦均在未避孕的條件下2年未懷孕。男性患者沒有吸煙史。精子密度>20x10<'9>/L，前向活動率<25﹪，精子正常形態(tài)率<30﹪。本研究的所有的不育患者在過去的三個月內沒有進行藥物或手術治療。體格檢查和內分泌檢查(血清

10、FSH，LH，T)正常。 首先，對于所獲得的男性不育患者精液樣本和有生育能力志愿者的精液樣本分別通過DGC的方法進行處理，處理后的精子分別采用．Annexin-V/PI雙染的方法檢測精子細胞膜的PS的外顯。采用JC-1( 5,5',6,6'-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylbenimidazolyl carbocyanine iodide)染色的方法檢測精子的MMP的改變情況。采用末端轉移酶介導的

11、dLTP末端標記法(TUNEL)檢測精子核DNA的完整性，對所獲得的兩組的結果進行對比。另外，男性不育患者精液樣本經DGC方法處理后，我們對所獲得的精子(aliquot A)的PS外顯情況和MMP及TNEL結果進行相關性分析。 其次，對于男性不育患者精液DGC處理后所獲得的精子(aliquot A)采用MACS的方法進行磁性篩選分離，分離出Annexin V陽性群體精子(aliquot B)和AnnexinV陰性群體精子(ali

12、quot C)。對于這三群精子分別用Annexin-V/PI雙染的方法檢測精子細胞膜的PS的外顯。采用JC-1染色的方法檢測精子的MMP的改變情況。采用TUNEL的方法檢測精子核DNA的完整性的情況。 結果：本研究包括15位不育患者和10位生育能力正常的志愿者。常規(guī)精液檢測顯示：有生育能力的志愿者的精子密度為83.99±20.77×10<'6>/ml，精子前向運動率54.90±7.91﹪，正常形態(tài)率37.60±5.15﹪。而不育

13、患者群體的精子密度為81.40士19.08×10<'6>/ml，精子前向運動率為18.53±2.50﹪，精子正常形態(tài)率為14.33±5.95﹪。該結果顯示：不育患者群體與有生育能力的志愿者的群體相比較，精子群體明顯存在前向活動率低而畸形率高的現(xiàn)象。 本研究顯示：通過Annexin-V/PI-染色，精子群體可被分為4個亞群：無PS外顯的活精子，即‘AN-/PI-’精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染時，熒光顯微鏡下觀察整

14、個精子無熒光；有PS外顯的活精子，‘AN+/PI-’精子，即，早期凋亡的精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染熒光顯微鏡下觀察整個精子呈現(xiàn)綠色熒光；有PS外顯的死精子，‘AN+/PI+’精子，即，晚期凋亡的精子，該亞群精子在Annexin-v/PI雙染時在熒光顯微鏡下觀察精子頭部細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，而細胞核呈現(xiàn)紅色熒光；無PS外顯的死精子，即‘AN-/PI+’精子，該亞群精子在Annexin-V/PI雙染時，在熒光顯微鏡下觀察，

15、精子頭部呈現(xiàn)紅色熒光。 在本研究中，10位生育能力正常的志愿者的精液通過DGC處理后所獲得的精子通過Annexin-V/PI染色，其各亞群比率分別如下：‘AN-/PI-’精子，88.90±6.40﹪；‘AN+/PI-’精子，4.30±2.26﹪；‘AN+/PI+’精子，3.70±2.91﹪：‘AN-/PI+，精子，3.0±2.18﹪。而15位不育患者群體的精液通過DGC處理后所獲得的精子通過Annexin-V/PI染色，各亞群比

16、率分別為：‘AN-/PI-’精子，74；20±8.50﹪；‘AN+-/PI-’精子, 11.40±5.00﹪；‘AN+/PI+’精子，8.93±3.28﹪；‘AN-/PI+’精子，5.47±0.92﹪。結果顯示：不育患者群體的精子細胞膜PS的外顯率明顯高于有生育能力志愿者的群體(‘AN+/PI-’，P<0.001；‘ANl+/PI+’，P=0.001：‘AN+/PI-，加‘AN+/PI+’，P<0.001)而‘AN-/PI-’精子比率顯