水稻蛋白質芯片的設計、構建及初步驗證.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是研究作物產量、轉基因、雜種優(yōu)勢、植物病蟲害抗性和其它抗逆等方面的重要遺傳材料，也是基礎研究的模式植物之一。水稻的生長發(fā)育過程幾乎都與蛋白激酶引起的信號轉導過程有關，研究激酶尤其是其磷酸化過程和篩選其下游底物，了解植物發(fā)育調控機理尤其是抗逆機理，對農業(yè)生產具有重要的意義。 本試驗建立了一種基于Pooling系統(tǒng)的水稻蛋白質芯片的方法，每個樣品接取10個水稻根eDNA庫克隆，誘導表達后，用溶菌酶高

2、通量地裂解提取蛋白質，總共提取了60板(96孔板)來自于水稻cDNA庫表達的β-gal融合蛋白質，共6000個樣品，大約涵蓋60000個克隆；再把所提取的蛋白質進行l(wèi)O倍的Pooling，得到Pooling之后的蛋白質樣品15板，所含樣品數為1200個。應用Dotblotting的方法，檢測了所有混合蛋白質的基本表達情況，另外表達了一板蛋白質，包括57個GST-水稻蛋白激酶和4個MBP-水稻蛋白質，將所有這76板蛋白質點在同一張芯片上。

3、用Anti-β-gal和Anti-GST雜交芯片檢測芯片質量，并利用該芯片對水稻蛋白激酶PI-D2進行了作用底物初步篩選的研究。結果如下： 1．基于Pooling的方法，表達了大約60000個水稻根cDNA克隆的蛋白質。 2．利用溶菌酶裂解的方法，方便地同時提取多個蛋白質，滿足了構建水稻蛋白質庫需大量提取蛋白質的需要。 3．用Dot blotting方法檢測了基于Pooling系統(tǒng)提取的水稻庫混合蛋白質的表達情況

4、，結果表明，蛋白質庫質量的表達水平能夠用來點制水稻蛋白芯片。 4．制備了含有7271個蛋白質樣品的水稻蛋白質芯片，并用Anti-β-gal和Anti-GST抗體對水稻蛋白質芯片進行質量檢測，結果說明蛋白芯片質量較好。 5．用該水稻蛋白質芯片，進行了水稻蛋白激酶PI-D2作用底物初步篩選的研究，獲得了一些可能的候選底物。 基于Pooling構建的水稻蛋白質芯片，減少了工作量，節(jié)約了成本和試劑用量。該芯片可能具有多種