MAPK信號通路在糖尿病性心肌病炎性反應中的作用及機制.pdf

1、目的：
　　本課題通過對大鼠胚胎心肌細胞（H9c2）進行高糖高脂干預，建造糖尿病心肌病肥厚模型，通過檢測MAPK信號蛋白明確其對糖尿病心肌病中炎性反應的影響。
　　方法：
　　實驗分為三部分：（1）采用隨機數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞隨機分組，每組設6個平行孔：對照組、高糖高脂A（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉250μmol/L）、高糖高脂B（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）、高糖高脂C

2、（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉1000μmol/L）不同時間（12h、24h、36h、48h)處理組。采用熒光定量PCR（RT-PCR）技術分別檢測心肌肥大相關指標心房鈉尿肽（ANP）、α-肌動蛋白（α-SKA）的mRNA表達；利用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）對各組細胞進行染色，觀察高糖高脂對H9c2心肌細胞肥大程度的影響；檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，觀察高糖高脂對H9c2心肌細胞損傷程度的影響。（2）結合第一部分實

3、驗，采用隨機數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞分組，每組設立6個平行對照孔：對照組、高糖高脂組（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）處理24小時。利用蛋白免疫印跡(Western blot)技術檢測 p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度，觀察高糖高脂與MAPK家族信號活化關系。（3）結合前兩部分實驗，采用隨機數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞分組，每組設立6個平行對照孔，對

4、照組、高糖高脂組、抑制劑組（SB203580+高糖高脂組）。采用流式細胞術檢測各組細胞中活性氧（ROS）的含量；通過化學檢測法檢測各組一氧化氮（NO）的水平；ELISA法檢測各組細胞3-硝基酪氨酸（3-NT）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）的分泌程度，觀察高糖高脂對H9c2心肌細胞炎癥通路的影響及MAPK家族與炎性反應之間的關系。
　　結果：
　　1.高糖高脂處理導致H9c2細胞呈時間和濃度依賴性肥大和損

5、傷。與對照組相比，高糖高脂處理后，ANP表達隨著濃度和時間的逐漸增加而升高，且在36h高糖高脂B處理組ANP的表達量達到高峰（P<0.01）；相比對照組而言，高糖高脂促進α-SKA表達，但α-SKA的表達在36h高糖高脂B處理組達到最高（P<0.05），與ANP的結果一致；與對照組相比，H9c2細胞的表面積變化與高糖高脂呈時間濃度依賴性，此外在36h高糖高脂B處理組，細胞的表面積變化最顯著（P<0.01），但36h高糖高脂C處理組的細胞

6、形態(tài)改變異常；同時H9c2細胞上清中LDH的活性與高糖高脂處理間呈濃度及時間依賴性（P<0.05)。據(jù)此，采用高糖高脂B（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）干預細胞36h為后續(xù)實驗的干預濃度和時間。
　　2.高糖高脂處理后 H9c2細胞MAPK信號途徑顯著活化。與對照組相比，高糖高脂組中 ERK、JNK、p38磷酸化水平明顯提高，其中p-ERK和p-JNK的水平分別增加了1.39倍和1.47倍（P<0.05），而

7、p-p38的活化水平增加了3.34倍（P<0.01）。
　　3.高糖高脂顯著誘導炎癥反應變化并可被p38 MAPK抑制劑抑制。與高糖高脂組相比，抑制劑組（SB203580+高糖高脂組）可降低ROS含量、NO水平、3-NT含量、IL-6和IL-1β的分泌量（P<0.05）。
　　結論：
　　1.高糖高脂可增加ANP及α-SKA的表達并使H9c2細胞表面積顯著增加，且可使細胞上清中的LDH水平升高，這提示高糖高脂可顯著誘導