蛋白激酶D在糖尿病心肌病中的作用及分子機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　論文Ⅰ 蛋白激酶D在糖尿病心肌病中的作用及厄貝沙坦干預研究
　　糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種與糖尿病相關的心肌結構改變及功能異常，通常表現為進行性左室肥厚及舒張和/或收縮功能障礙，其病理特點為心肌細胞肥大、凋亡，微血管病變及間質纖維化等。1972年Rubler等首次提出糖尿病心肌病這一概念，近40余年來，國內外學者在此領域中進行了大量的基礎

2、和臨床研究，證實DCM是糖尿病患者高心力衰竭發(fā)生率和高死亡率的主要原因。DCM作為糖尿癇獨立的并發(fā)癥目前已被肯定，并逐漸被臨床醫(yī)生和流行病專家所重視。
　　蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)是從蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)家族中獨立出來的一類特殊的蛋白激酶家族，屬于作為Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶家族成員。PKD家族包含三個亞型PKD1，PKD2，PKD3，通常所說的PKD即指的是

3、PKD1。PKD參與多種細胞生物學反應，包括:信號轉導、核膜轉位、蛋白運輸、細胞的增殖、肥大、遷移、分化以及調亡等。PKD在心血管系統(tǒng)的很多方面都發(fā)揮重要作用，例如PKD可以使肌鈣蛋白Ⅰ磷酸化，同時降低肌絲Ca2+的敏感性，調節(jié)肌絲的功能;心臟持續(xù)高表達活化PKD的轉基因大鼠心肌肥厚顯著，且最終引起心室壁變薄，心腔擴大，心功能惡化，證實了PKD活性增加足以引起失代償性心肌重構。
　　本研究采用高脂喂養(yǎng)+小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方

4、法建立2型糖尿病大鼠模型，探討厄貝沙坦改善糖尿病心肌病的作用及其可能機制。
　　目的：
　　1.建立2型DCM大鼠模型，探討PKD及ERS在糖尿病心肌損害中的作用;
　　2.明確厄貝沙坦改善DCM的作用，探討其心肌保護作用是否通過PKD及ERS信號通路介導。
　　方法：
　　1.2型糖尿病大鼠動物模型的建立
　　60只體重120-140g（約5周齡）的雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為5組:對照組

5、(Control)、糖尿病組（DM組）、糖尿病+厄貝沙坦15mg/kg組（DM+Irb-15組）、糖尿病+厄貝沙坦30mg/kg組（DM+Irb-30組）和糖尿病+厄貝沙坦45mg/kg組（DM+Irb-45組）。Control組大鼠喂以基礎飼料，其余四組大鼠喂以高糖高脂高熱量飼料。
　　2.血清學指標檢測
　　于實驗結束前，大鼠禁食禁水12小時，收集外周靜脈血，分離血清，行血清學指標檢測。檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(

6、TC)和甘油三酯(TG)及空腹胰島素(FINS)水平，計算胰島素敏感指數(ISI)，ISI=ln(FBG×FINS)-1。
　　3.血壓和心率的測量
　　大鼠處死前，利用大鼠尾動脈血壓測量儀測量大鼠尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動脈壓(MBP)和心率(HR)，每只大鼠測量3次取平均值。
　　結果：
　　1.厄貝沙坦對2型糖尿病大鼠血壓及代謝指標的影響
　　與Control組相比，DM組大鼠F

7、BG、TG、TC和FINS水平明顯升高，胰島素敏感指數顯著降低(p＜0.05)。DM組大鼠血壓與對照組無明顯差異(p＞0.05)。
　　30mg/kg和45mg/kg厄貝沙坦可顯著降低DM大鼠FINS水平(p＜0.05)，改善DM大鼠的胰島素敏感指數(p＜0.05)，15mg/kg厄貝沙坦干預無明顯影響。各劑量組厄貝沙坦對DM大鼠血糖、血壓及血脂水平無明顯影響(p＞0.05)。
　　2.厄貝沙坦改善2型糖尿病大鼠左室功能障礙

8、
　　與Control組相比，DM組大鼠出現左室舒張功能障礙，表現為E/A顯著降低(p＜0.05)，E/E'顯著升高(p＜0.05);同時伴有左室收縮功能的下降，表現為LVEF、FS顯著降低(p＜0.05)。30mg/kg和45mg/kg厄貝沙坦干預可顯著改善糖尿病大鼠左室舒張及收縮功能障礙(p＜0.05)。
　　3.厄貝沙坦改善2型糖尿病大鼠的左室重構
　　DM組大鼠的心臟重量/體重比值(HW/BW)較Control

9、組顯著增加(p＜0.05)。DM組大鼠的心臟明顯擴大，左室室壁增厚，鏡下觀察，心肌細胞肥大，扭曲，排列紊亂，間隙增大，斷裂細胞增加。Masson及天狼猩紅染色顯示:與Control組比較，DM組大鼠的心肌間質膠原沉積顯著增加，膠原纖維排列紊亂。
　　結論：
　　1.2型糖尿病大鼠心肌組織中磷酸化PKD表達升高，且與心肌間質纖維化、心肌細胞凋亡水平及左室舒張功能障礙相關;
　　2.厄貝沙坦可劑量依賴性的改善2型糖尿病大鼠

10、的左室重構及功能障礙;
　　3.厄貝沙坦對DCM的心臟保護作用與其抑制心肌組織PKD和內質網應激的激活有關。
　　論文Ⅱ 蛋白激酶D在高糖誘導的心肌細胞凋亡中的作用及機制研究
　　內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導的細胞凋亡在DCM病程中發(fā)揮重要作用。ERS早期表現為抑制蛋白質的翻譯和轉運，誘導內質網相關性降解（endoplasmic reticulum associat

11、ed degradation，ERAD），進而減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網的積聚等，保持內質網的穩(wěn)態(tài)及正常功能。但當應激持續(xù)存在或強度超過內質網自身處理能力時，則可啟動由C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminalkinase，JNK）及caspase-12途徑介導的細胞凋亡。
　　蛋白激酶D(protein kinase D

12、，PKD)是一種新發(fā)現的胞漿絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent proteinkinase，CAMK)家族成員。以往研究顯示PKD參與細胞凋亡的調控過程，PKD對細胞凋亡調控作用可因細胞類型和激活途徑的不同而不同，具體機制也需進一步探討。我們的前期研究顯示PKD參與DCM的發(fā)生發(fā)展過程，且PKD的活化與心肌細胞凋亡相關。多項研究表明，蛋白激酶C(protein

13、 kinase C，PKC)及其下游信號通路可通過調控ERS進而參與細胞凋亡。心肌細胞中PKD的活化依賴于PKC，PKD作為PKC的主要下游分子之一，在PKC介導的細胞生物學作用中發(fā)揮重要作用。然而，PKD是否參與ERS的調控目前尚無報道。
　　目的：
　　1.探討高糖對心肌細胞PKD的表達及活化的影響;
　　2.探討內質網應激IRE1α/CHOP通路在高糖誘導的心肌細胞凋亡中的作用;
　　3.探討PKD在高糖誘

14、導的心肌細胞凋亡中的作用及其信號轉導機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　以H9c2大鼠心肌細胞系為研究對象，以5.5mmol/L的正常糖培養(yǎng)基作為正常對照(control)，采用33mmol/L的葡萄糖作為高糖刺激(HG)，體外模擬糖尿病狀態(tài)，并以5.5mmol/L的葡萄糖+27.5mmol/L的甘露醇作為高滲對照(OC)，觀察高糖刺激對心肌細胞凋亡的影響。
　　2.細胞干預
　　設計、合成PKD-s

15、iRNA及IRE1α-siRNA，采用脂質體轉染H9c2心肌細胞，分別觀察抑制PKD及IRE1α的表達對高糖誘導的心肌細胞凋亡的影響。將心肌細胞分為以下幾組進行干預:control組、HG組、HG+PKD-siRNA組、HG+IRE1α-siRNA組和HG+N.C-siRNA組。
　　3.TUNEL染色檢測細胞凋亡
　　采用TUNEL染色，檢測不同刺激條件下心肌細胞的凋亡情況，計算細胞凋亡率。
　　結果：
　　1

16、.高糖刺激誘導H9c2心肌細胞凋亡
　　分別采用高糖培養(yǎng)心肌細胞0h、12h、24h和48h，并以正常糖及高滲培養(yǎng)作為對照，觀察高糖刺激對心肌細胞凋亡的影響。Western blot檢測結果顯示，與正常對照組相比，高糖刺激24h和48h，心肌細胞Cleaved caspase-3的表達明顯升高(p＜0.05)，Bax/Bcl-2比值顯著增加(p＜0.05);TUNEL檢測結果顯示，高糖刺激24 h和48 h，心肌細胞凋亡率顯著增加

17、(p＜0.05)，高滲對照組心肌細胞凋亡率與正常對照組無顯著差異(p＞0.05)。
　　2.高糖刺激誘導H9c2心肌細胞PKD的活化
　　與正常對照組相比，高糖刺激12h、24h和48h對心肌細胞PKD的表達無明顯影響(p＞0.05);高糖刺激12h后p-PKD的表達有所增加，但與正常對照組無顯著性差異(p＞0.05)，高糖刺激24h和48h均能顯著增加心肌細胞p-PKD的蛋白表達(p＜0.05);高滲培養(yǎng)12h、24h和4