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文檔簡介
1、目的
近年來,我院臨床感染的銅綠假單胞菌中出現(xiàn)一種新的耐藥表型,對碳青霉烯類抗生素耐藥,卻對頭孢他啶敏感,對頭孢吡肟敏感或中介。本研究旨在探討介導此型耐藥的機制,為臨床治療、預防和感控提供理論基礎。
方法
1.收集確認表型:臨床分離經(jīng)法國生物梅里埃Vitek2-compact全自動微生物分析儀鑒定的該型銅綠假單胞菌,用瓊脂稀釋法復查藥物敏感性,確認為此耐藥新表型。
2.β-內酰胺酶
2、分析:用反復凍融方法提取細菌耐藥酶,通過改良三維試驗檢測該型菌是否產能分解碳青霉烯類和頭孢他啶、頭孢吡肟等藥物的β-內酰胺酶。
3.影響碳青霉烯類藥物進入細菌的外膜蛋白通道及編碼通道蛋白的基因分析:運用超聲破碎法提取細菌外膜蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析耐藥株是否發(fā)生外膜蛋白的改變。在此基礎上,提取細菌DNA,擴增編碼外膜蛋白的oprD基因,進行測序分析,尋找引起外膜蛋白改變的基因基礎。同時用
3、實時定量RT-PCR檢測oprD基因表達量是否存在變化。
4.可能導致碳青霉烯類藥物外排的因素分析:運用實時定量RT-PCR檢測編碼銅綠假單胞菌外排泵系統(tǒng)的mexA,mexC,mexE和mexY是否存在過度表達,其調控基因是否存在改變。
5.體外模擬試驗:用亞胺培南和美羅培南對敏感的銅綠假單胞菌進行體外誘導試驗,觀察是否能誘導出相同的耐藥表型,并按上述研究方法檢測誘導株是否存在相同的基因型變化,證實對臨床分離
4、株的研究結果。
結果
1.共收集了29株該類型的銅綠假單胞菌,最低抑菌濃度(MIC)結果為對亞胺培南和美羅培南輕度或中度耐藥,對頭孢他啶和頭孢吡肟為敏感或者中介。
2.全部29株菌均不產生碳青霉烯酶,和能分解頭孢他啶和頭孢吡肟的β-內酰胺酶。
3.與銅綠假單胞菌ATCC27853和臨床分離的碳青霉烯類敏感株相比,29株菌中,7株外膜蛋白整體缺失或減少,18株在Mr43000~660
5、00之間可見Mr46000外膜蛋白明顯缺失或者減少,4株外膜蛋白無明顯改變。對oprD基因測序發(fā)現(xiàn)在外膜蛋白改變的菌株中存在多點突變、少量缺失,新堿基插入,以及提前出現(xiàn)終止密碼子。結果導致外膜蛋白的改變和丟失。
4.外排系統(tǒng)調控基因發(fā)生點突變,導致外排系統(tǒng)基因的過度表達,產生過多的外排泵蛋白質。其中以mexXY-OprM和mexAB-OprM過度表達為主,其他外排系統(tǒng)有個別表達增加。
5.采用亞胺培南和美羅培
6、南誘導后,第5天出現(xiàn)對2種藥物的耐藥,且美羅培南誘導株對2種藥物敏感性降低速度明顯快于亞胺培南誘導株:三維試驗誘導株未檢出相應的耐藥酶;SDS-PAGE電泳顯示Mr46000外膜蛋白有缺失或者減少;oprD外膜蛋白基因測序發(fā)現(xiàn)有堿基突變產生終止密碼子以及新的堿基插入導致移碼突變。外排基因表達顯示以MexA過度表達為主,同時伴有其他外排系統(tǒng)的過度表達。穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)5株誘導株的耐藥表型穩(wěn)定,另1株外排系統(tǒng)表達量呈現(xiàn)持續(xù)升高,導致MIC值的
7、升高。
結論
1.不產生碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌,對碳青霉烯類藥物的耐藥與編碼外膜蛋白OprD的基因發(fā)生堿基缺失、突變、插入相關,這些改變引起藥物進入菌體的外膜蛋白通道改變使藥物更不易進入,是導致此型銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要原因。
2.外排系統(tǒng)調控基因突變引起外排泵mexXY-OprM和mexAB-OprM的過度表達,使進入菌體藥物逆濃度差被大量排出,是導致此型銅綠假單胞菌對美羅培南耐藥
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