河南地區(qū)耐碳青霉烯類藥物銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是醫(yī)院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一，特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房、呼吸科以及燒傷科。該菌正常情況下不會(huì)引起人類疾病，當(dāng)人體免疫力低下、定植部位改變以及菌群失調(diào)時(shí)，導(dǎo)致人類感染。近些年來，由于抗生素的濫用情況日益嚴(yán)重，又因其固有的和獲得性的耐藥機(jī)制而使其對(duì)多種藥物都能產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥，從而出現(xiàn)了多重耐藥(multi-drugresistant,MDR)甚至泛耐藥(p

2、an-drugresistant,PDR)銅綠假單胞菌。
　　碳青霉烯類抗生素是臨床治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的重要手段之一。但是，隨著抗生素的濫用越來越嚴(yán)重，菌株對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，耐藥率呈逐年增高趨勢(shì)，臨床對(duì)于此類細(xì)菌所致感染幾乎陷于束手無策、無藥可用的困境。
　　銅綠假單胞菌針對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥主要有幾個(gè)方面的原因，具體包括碳青霉烯酶的產(chǎn)生、主動(dòng)外排泵過度表達(dá)、外膜通透性的改變、整合子介導(dǎo)耐藥性改變

3、等，其中，最為主要的是碳青霉烯酶的產(chǎn)生和外膜通透性的改變。
　　碳青霉烯酶按Ambler分類分為三類，銅綠假單胞菌攜帶的主要是AmblerB類金屬酶。而產(chǎn)生AmblerB類金屬酶是目前該菌株對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因。資料顯示，國(guó)內(nèi)外主要檢測(cè)到六種AmblerB類金屬酶，分別為IMP、VIM、SPM、SIM、GIM和NDM。銅綠假單胞菌攜帶的主要是IMP和VIM。早期發(fā)現(xiàn)的OXA酶屬于窄譜性水解酶類，如0XA-1、0XA-2、

4、OXA-10等。近年來，超廣譜性O(shè)XA酶,甚至水解碳青霉稀類的OXA酶報(bào)道不斷增多，但這些酶類除OXA-15和OXA-32超廣譜酶外,其它的廣譜OXA酶大多來自O(shè)XA-10的突變。外膜孔蛋白OprD2（outer-membraneproteinD2，OprD2）的缺失也可導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥，并且通道蛋白的缺失往往伴隨有外排泵系統(tǒng)系統(tǒng)的過度表達(dá)，這兩者都在碳青霉烯類藥物耐藥產(chǎn)生過程中起著重要作用。整合子是細(xì)菌間的可移動(dòng)遺

5、傳元件，其上多定位有多種耐藥基因，且可在同種或異種細(xì)菌間傳遞，從而導(dǎo)致耐藥性廣泛傳播。目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的整合子主要有三類，分別為intⅠ、intⅡ、intⅢ，銅綠假單胞菌主要攜帶的為Ⅰ類整合子。
　　依據(jù)國(guó)內(nèi)外針對(duì)銅綠假單胞菌耐藥性的研究現(xiàn)狀，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題，旨在通過分析本地區(qū)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥性表型，探究菌株所攜帶的碳青霉烯酶基因型種類、菌株通道蛋白表達(dá)狀況以及菌株所攜帶整合子及其耐藥基因盒種類，從而揭示本地區(qū)的銅綠

6、假單胞菌耐藥機(jī)制，為臨床抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　1.菌株收集
　　收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年5月-2015年10月間的耐碳青霉烯類（亞胺培南或美羅培南）目的菌株86株，每株菌株均采用VITEKⅡ全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定到種，并采用VITEKⅡ配套藥敏卡片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果判定參考CLSI2014版標(biāo)準(zhǔn)。采用-20℃保存菌株。
　　2.耐藥分析
　　統(tǒng)計(jì)分析所收集菌株的科室分布、標(biāo)

7、本類型、各類常用抗生素耐藥率，并以同時(shí)期收集的86株碳青霉烯類敏感銅綠作為對(duì)照組，比較兩組菌株間耐藥性差異。比較方法采用卡方檢驗(yàn)。
　　3.表型確證
　　將菌株復(fù)蘇后，挑取單個(gè)菌落制作0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海鶆蛲坎糓-H平板后，采用EDTA雙紙片增效試驗(yàn)篩查產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌。
　　4.基因檢測(cè)
　　用特異性引物序列，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，檢測(cè)A、B、D類碳青霉烯酶，Oprd2孔道蛋白以及整合子。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行

8、瓊脂糖凝膠電泳后，將陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.科室、標(biāo)本類型分布
　　86株目的菌株主要來源于ICU39個(gè)、介入科12個(gè)、神經(jīng)外科12個(gè)，其它科室23個(gè)。從標(biāo)本類型上看，主要是痰標(biāo)本70、灌洗液4、分泌物4，其他標(biāo)本包括2個(gè)膽汁、2個(gè)引流液、2個(gè)尿、2個(gè)膿液。
　　2.耐藥率分析
　　耐碳青霉烯類藥物PA對(duì)于臨床常用抗菌藥物的耐

9、藥率如下，阿米卡星40％、哌拉西林74%、頭孢他啶53%、頭孢吡肟47%、美羅培南89%、亞胺培南90%、氨曲南74%、環(huán)丙沙星51%、左氟沙星56%。由結(jié)果可知，菌株除了耐碳青霉烯類藥物外，對(duì)于氨基糖苷類、廣譜青霉素及喹諾酮類藥物均有較高的耐藥率。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析與86株碳青霉烯類敏感菌對(duì)各類藥物的差異性，每組藥P均小于0.05，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，認(rèn)為耐碳青霉烯類PA和碳青霉烯類敏感PA對(duì)常見種類抗生素的耐藥率有顯著性差異。

10、
　　3.基因型檢測(cè)
　　86株銅綠假單胞菌中擴(kuò)增出B類金屬酶IMP11株、SIM2株、18株含有OXA-10，未檢測(cè)到A類碳青霉烯酶GES。86株銅綠假單胞菌中，有54株菌株存在孔道蛋白缺失，僅32株擴(kuò)增出通道蛋白，孔道蛋白缺失率達(dá)到63%。
　　4.整合子檢測(cè)
　　86株目的菌中，26株擴(kuò)增出Ⅰ類整合子，未擴(kuò)增出Ⅱ、Ⅲ類整合子，4株擴(kuò)增出1850bp長(zhǎng)度的基因盒（dhfrXⅡ-orfF-aadA2），4株20

11、00bp基因盒（aadB-aaC6-Ⅱ-PSE1），2株1270bp基因盒（aadA6-orfD），2株2000bp（imp26-qacG-aacA4）,13株1000bp（aadA2）,1株1600bp（aadA4-OXA142）。
　　結(jié)論：
　　1.耐碳青霉烯類藥物銅綠假單胞菌往往具有多重耐藥性，臨床應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，嚴(yán)防此類菌株的擴(kuò)散。
　　2.河南地區(qū)分離PA對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制為攜帶碳青霉烯酶以及通道蛋白的