美國(guó)紅魚致病性弧菌分離鑒定與免疫防治技術(shù)研究.pdf

1、美國(guó)紅魚學(xué)名眼斑擬石首魚(Sciaenops ocelcatus)屬鱸形目、石首魚科、擬石首魚屬，為浙江、福建主要養(yǎng)殖魚類之一。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖集約化發(fā)展，美國(guó)紅魚病害頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重制約著其人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展急需對(duì)其病害進(jìn)行免疫防治技術(shù)研究。本文分析了從患潰爛癥的美國(guó)紅魚體內(nèi)分離到的優(yōu)勢(shì)菌株M-1的致病性和分類學(xué)地位，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步研究了用該菌制備的滅活疫苗對(duì)美國(guó)紅魚的免疫效果，最后又對(duì)中草藥制劑對(duì)影響美

2、國(guó)紅魚免疫的機(jī)能進(jìn)行了探討。獲得的結(jié)果如下： 1、從患潰爛癥的美國(guó)紅魚分離到優(yōu)勢(shì)菌株M-1，人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌為美國(guó)紅魚的致病菌。對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化特性分析，同時(shí)測(cè)定了菌株M-1的16S rRNA和HSP60基因序列，分析相關(guān)細(xì)菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，菌株M-1與燦爛弧菌(AJ874361)的親緣關(guān)系最近，具有96.1％的同源性；HSP60基因序列分析表明M-

3、1與弧菌(EU653883)聚為一個(gè)分支。綜合上述結(jié)果，可鑒定菌株M-1為燦爛弧菌，命名為燦爛弧菌M-1菌株(Vibriosplendidus M-1)。藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株對(duì)菌必治、復(fù)方新諾明、先鋒必等9種藥物敏感。 2、采用梯度法比較了培養(yǎng)時(shí)間、溫度、鹽度、初始pH值、菌液起始濃度等對(duì)燦爛弧菌M-1菌株生長(zhǎng)的影響；采用正交試驗(yàn)法對(duì)Zobell2216 E培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：M-1菌株產(chǎn)最大活菌數(shù)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)

4、間48 h、溫度32℃、鹽度40、初始pH值8.0、菌液起始濃度為1×105CFU/mL；最佳培養(yǎng)基成分為：蛋白胨7.5 g/L、酵母浸出膏1.5 g/L、CuSO40.075 mg/L、CaCl20.04 g/L。 3、制備燦爛弧菌福爾馬林滅活疫苗。通過(guò)浸泡、注射和口服等3種方式接種美國(guó)紅魚，分別在接種免疫后第7、14、21、28、35 d采魚血，檢測(cè)其血清抗體效價(jià)、溶菌酶活力和白細(xì)胞吞噬活性；第28 d用1.0×108CFU

5、/mL的燦爛弧菌菌懸液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)來(lái)比較疫苗的免疫效果。結(jié)果表明，各免疫組血清抗體效價(jià)在第21 d達(dá)到峰值，且浸泡組和注射組的血清抗體效價(jià)高于口服組；在35 d實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，各免疫組的血清溶菌酶活力有明顯提高，各浸泡組和注射組于免疫接種后14 d顯著高于對(duì)照組水平(P<0.05)；除浸泡組3外，其余各免疫組的白細(xì)胞吞噬百分比(PP)和吞噬指數(shù)(PI)在免疫接種后14 d均較對(duì)照組有顯著升高(P<0.05)；各組受免魚對(duì)人工攻毒均具有保護(hù)作用

6、，注射組2的免疫保護(hù)率最高達(dá)77.8％。 4、用分別含連翹、豬苓、黃芩、茯苓和黃連水提取物的配合餌料飼喂美國(guó)紅魚，研究其對(duì)美國(guó)紅魚生長(zhǎng)和免疫機(jī)能的影響。結(jié)果表明：投喂含有黃芩和茯苓的藥餌可使美國(guó)紅魚的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率和相對(duì)增重率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；投喂5種含中草藥的藥餌后，美國(guó)紅魚血液白細(xì)胞的吞噬活性有明顯提高，投藥后3 d，除茯苓組外，其余各組吞噬百分比(PP)比對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)；在投藥后3 d或7 d，

7、連翹、黃芩和黃連組的吞噬指數(shù)(PI)與對(duì)照組相比有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。在停投藥餌后7 d，除茯苓組外，其余各組PP、PI與對(duì)照組相比仍有顯著差異(P<0.05)。同時(shí)，美國(guó)紅魚血清溶菌酶活性也有顯著提高，投藥后7 d，溶菌酶活性與對(duì)照組之間差異極顯著(P<0.01)，但在停投藥餌后7 d，溶菌酶活性與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；投藥28 d后，利用哈維氏弧菌人工感染美國(guó)紅魚，黃芩組的相對(duì)免疫保護(hù)率