金黃色葡萄球菌表面多糖偶聯(lián)抗原的制備及其免疫原性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎以及醫(yī)院臨床感染的主要病原，對該菌感染的防治主要采用抗生素進行治療。然而，長期、大量的抗生素應用導致細菌耐藥性的增強和蔓延，使防治難度不斷加大。此外，用抗生素治療奶牛乳房炎還存在奶產(chǎn)品抗生素殘留，影響食品安全。研制和開發(fā)有效疫苗，通過免疫接種進行金黃色葡萄球菌感染的預防已成為近年來研究的熱點。
　　 表面多糖（CP5、CP8和336PS）是金黃色葡萄球菌的主要共同性抗原成分和毒力因子，也是疫苗開發(fā)的主要

2、靶抗原。該類多糖的分子量小，免疫原性差，通過技術方法改善其免疫原性對于研制有效疫苗至關重要。本研究分別對金黃色葡萄球菌的3種重要表面多糖進行了提取、純化、蛋白載體偶聯(lián)和偶聯(lián)抗原的免疫原性研究。
　　 首先采用高壓破碎法使莢膜多糖CP5和CP8從金黃色葡萄球菌菌體釋放，選用不同的酶處理去除破碎產(chǎn)物中的核酸和蛋白，再通過離子交換層析獲得一定純度的CP5、CP8莢膜多糖。表面多糖336PS的獲取則采用溶葡萄球菌酶消化法使其從菌體釋放，

3、梯度乙醇浸提和不同酶的消化進行粗提，再通過凝膠層析純化，得到了一定純度的336PS多糖。
　　 研究建立了金黃色葡萄球菌表面多糖的化學檢定方法。檢測結(jié)果表明，CP5、CP8、336PS的純度分別為67.51%、63.83%和68.51%；用免疫瓊脂雙擴散試驗檢測，純化的多糖僅與抗同型菌株免疫血清發(fā)生沉淀反應。
　　 研究制備了3種表面多糖的蛋白偶聯(lián)抗原，并對偶聯(lián)抗原的免疫原性進行了檢測。將純化表面多糖通過ADH間橋法和E

4、DAC零距離交聯(lián)法與BSA偶聯(lián)，凝膠過濾層析純化，紫外掃描鑒定，從檢定波長判定偶聯(lián)成功。分別制備了6種表面多糖偶聯(lián)抗原的油佐劑亞單位疫苗免疫小鼠，并以同樣的方式制備3種未偶聯(lián)表面多糖、PBS疫苗做對照。分別在免疫前，免疫第14 d和第28 d采集各組免疫小鼠血，分離血清，用間接ELISA檢測血清中針對抗表面多糖的抗體水平。檢測結(jié)果表明：2種偶聯(lián)方法制備的抗原都能刺激機體產(chǎn)生抗良好的免疫應答反應，而未偶聯(lián)的多糖則無免疫原性。
　　

5、 為了解該抗體的的免疫保護性，在第28 d加強免疫一次，7天后后腿外側(cè)注射同型菌株，觀察小鼠后腿外側(cè)臨床病理變化并進行臨床指數(shù)評分。攻毒實驗表明，偶聯(lián)抗原組能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┹^好的免疫保護作用。經(jīng)綜合分析，ADH間橋法制備的CP5-BSA、CP8-BSA和336PS-BSA偶聯(lián)抗原免疫效果優(yōu)于EDAC零距離交聯(lián)法。
　　 為克服載體蛋白BSA在奶牛免疫中免疫原性差的問題，采用基因工程方法，通過PCR擴增綠膿桿菌外毒素A基因（ET

6、A），構(gòu)建重組表達載體pET-28a-ETA，轉(zhuǎn)化進DH5α感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒pET-28a-ETA并進行雙酶切、PCR鑒定及測序鑒定。用IPTG進行誘導表達，對其產(chǎn)物進行SDS-PAGE和western blotting分析，并對誘導表達條件進行優(yōu)化，確定目的蛋白分布，最終批量進行表達。采用尿素對包涵體進行變性并確定最佳的復性條件和復性緩沖液，Ni-NTA樹脂柱上復性目的蛋白。柱上復性后目的蛋白的純度達到93%以上。