TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV(FJ06株)在人工感染豬體內(nèi)分布規(guī)律.pdf

1、本研究基于TaqMan探針技術(shù)，應(yīng)用熒光定量RT-PCR對(duì)豬繁殖與PRRSV(FJ06株)進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用此方法對(duì)人工感染PRRSV(FJ06株)的豬體內(nèi)各組織中PRRSV的含量進(jìn)行定量檢測(cè)，旨在建立一種快速高效的診斷方法，為PRRSV(FJ06株)的流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。 PRRSV(FJ06株)NSP2基因的克隆: 根據(jù)GenBank的變異性PRRSV和普通PRRSV的NSP2片段基因序列，設(shè)

2、計(jì)并合成一對(duì)引物。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV FJ06株，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出目的基因片段，將目的片段和PMD-18T Vector載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α。試驗(yàn)結(jié)果獲得預(yù)期的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。 PRRSV(FJ06株)的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立: 參照GenBank的變異性PRRSV和普通PRRSV的NSP2段基因序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異引物和TaqMan探針。以質(zhì)粒PMD-NSP2為模板，通

3、過(guò)條件優(yōu)化，以定量的10倍系列稀釋的質(zhì)粒PMD-NSP2為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 試驗(yàn)結(jié)果：建立了PRRSV(FJ06株)的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。建立的方法靈敏度可達(dá)6.24×102拷貝/μL，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，而與普通PRRSV、PCV2、PRV、HCV、FGE沒(méi)有交叉反應(yīng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合于變異性PRRSV的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。 PRRSV(F

4、J06株)在人工感染豬體內(nèi)各組織中含量的測(cè)定: 應(yīng)用TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)PRRSV(FJ06株)人工感染及其同居感染豬在第14d時(shí)體內(nèi)不同器官組織中的病毒RNA進(jìn)行定量檢測(cè)。 結(jié)果表明，被測(cè)定的14種器官組織均含有PRRSV(FJ06株)。心、肺、肺門(mén)淋巴結(jié)、扁桃體、腦、頜下淋巴結(jié)和血液中PRRSV(FJ06株)的含量較高。陰性對(duì)照豬的14種器官組織均未檢測(cè)到PRRSV(FJ06株)。 結(jié)論