水稻條斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1轉基因水稻的研究.pdf

1、水稻條斑病菌（Xanthornonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）是水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）種下的兩個致病變種之一，引起的水稻細菌性條斑?。l斑?。˙acterial Leaf Streak，BLS），近年來成為水稻上的重要病害。水稻條斑病菌同其他革蘭氏陰性植物病原細菌一樣擁有hrp基因簇，決定著病原細菌在非寄主植物上的過敏反應(hypersensitive response，HR)和

2、在感病寄主上致病性（pathogenicity）。與水稻互作時，水稻條斑病菌的hrp基因簇編碼形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)，將T3SS效應蛋白注入植物細胞中從而導致非寄主產(chǎn)生HR和在水稻上產(chǎn)生細菌性條斑病癥狀。水稻條斑病菌約27kb的hrp基因簇包括10個hrp，9個hrc（hrp-conserved）和8個hpa（hrp-associated）基因，也稱hrp-hrc-hpa基因簇，并由調節(jié)因子HrpG和HrpX調控。雖然水稻條斑病菌

3、的hrp-hrc-hpa基因與其它植物病原黃單胞菌中的hrp-hrc-hpa基因有較高的同源性，但每個基因對病原菌的致病性和毒性的貢獻并不清楚。本研究以野生菌株RS105為出發(fā)菌，利用自殺性載體pKMS1獲得了上述29個hrp基因的無標記缺失突變體。植物上接種結果顯示，hrc基因突變體全部喪失在非寄主上的HR和在水稻上的致病性（H印表型）;hpa基因對Hrp表型沒有顯著影響，僅hpaB和hpa1基因突變體分別喪失和減弱了在水稻上的致病性

4、;hrp基因中，除hrpF表現(xiàn)為毒性顯著減弱和仍能激發(fā)煙草HR以及hrpE3對Hrp表型沒有改變外，其他hrp基因突變后，病原菌均喪失Hrp表型。這些結果為進一步揭示hrp-hrc-hpa基因的具體功能奠定了基礎。
　　 為了揭示可能的調控因子對hrp-hrc-hpa基因調控關系，本研究根據(jù)其他植物病原黃單胞菌的研究結果，分別對全局性調控因子Trh、LrpX、ColR、ColS和Zur在水稻條斑病菌中的基因進行了敲除。水稻上的致

5、病性和煙草上的HR測定結果顯示，trh、lrpX、 colR、colS和zur突變體降低了水稻條斑病菌在水稻上的毒性，但不影響在煙草上的HR激發(fā)能力。
　　 水稻條斑病菌的hrp基因主要由調節(jié)因子HrpG和HrpX進行調控，但至今并不清楚是否HrpG和HrpX調控所有的hpa-hrp-hrc基因轉錄表達。RT-PCR結果顯示，hrcC、hrpD5、hrpE和hpa3基因的轉錄表達不完全依賴HrpG和HrpX的調控;hrcT受Hr

6、pX調控不受HrpG調控，hpa2受HrpG調控不受HrpX調控。另外發(fā)現(xiàn)，hrpD6基因突變后，hpa2、hpa1和hpaB基因不轉錄表達，hrcC和hrcT基因的轉錄表達水平下降。這說明，HrpG和HrpX通過調控hrpD6的表達而影響了hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的表達。
　　 為了了解其他全局性調控因子以及HrpG和HrpX對上述基因表達的調控作用，本研究將hrpA、hrpB、hrpC、hrpD和

7、hpa3轉錄單元的啟動子以及hrp基因簇中的啟動子進行了分析，認為它們的啟動子分別為phrcC、phrcT1、phrpD51和phpa3。通過軟件分析后還發(fā)現(xiàn)，hrpB轉錄單元中的hrcN和hrpD轉錄單元的hpaP基因內存在可能的啟動子，分別為phrcT2和phrpD52。將上述啟動子分別與gusA基因進行融合，導入野生菌中，在水稻細胞、hrp誘導培養(yǎng)基XOM3和NB中進行GUS活性測定。結果發(fā)現(xiàn)，phrcC、hrcT1、prhD51

8、和phpa3啟動子可以驅動gusA基因在水稻細胞和XOM3中誘導表達，而不能有效在NB中表達。相應的，phrcT2和phrpD52在三種條件下都能驅動gusA基因表達。
　　 為了排除全局性調控因子對上述基因表達差異的調控作用，本研究將上述hrp-gusA構建以及hrpG和hrpX基因的啟動子分別導入hrpG、hrpX、 trh、lrpX、 colR、colS和zur突變體中，結果發(fā)現(xiàn)，hrpA轉錄單元受HrpG、Zur、Col

9、R和Trh的正調控，不受HrpX、LrpX和ColS的調控;hrpB轉錄單元受HhpX正調控，不受其他因子的調控;hrpD轉錄單元同時受HrpG和HrpX調控，不受其他五個全局性調控因子的調控;hrpG基因受Trh正調控，不受其他調控因子的影響;hrpX基因受HrpG的正調控影響最大，其次受Zur和ColR的正調控，但還受LrpX的負調控作用。這表明，這些調控因子通過對hrpG或hrpX基因的轉錄調控作用而間接的影響hrp基因的轉錄表達

10、。而五個全局性調控因子以及HrpG和HrpX對phrcT2、phrpD52和phpa3沒有調控作用。這也提示，hrpD5、hrpE和hpa3的調控受到未知調控因子的作用。
　　 為了揭示這些因子在轉錄后水平上對hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3的調控作用，本研究利用Northern雜交對上述調控因子突變體中的hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3基因表達進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，hrpE基因在hrpX突變

11、體中仍然有低水平的轉錄，而在lrpX突變體中表達水平超過野生型。這提示，hrpE基因的表達并不受HrpG、Trh、ColR、ColS和Zur的調控，但受到HrpX的顯著正調控作用，并且LrpX對HrpX的負調控，導致hrpE轉錄水平升高。遺憾的是，hrcC、hrpD5和hpa3的mRNA水平太低，沒有雜交信號出現(xiàn)。
　　 由于hrpD5、hrpE和hpa3不完全依賴hrpG和HrpX調控，這促使本研究進一步對其所在的轉錄單元構成

12、進行分析。對phrpD51和phrpD52進行突變，經(jīng)誘導通過RT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)，hrpD轉錄單元的啟動子phrpD51突變后，除hrpD5和hrpE基因外，hrcQ、hrcR、hrcS、hpaP、hrpD6、hrpE和hpaB基因不轉錄表達，而可能的啟動子對上述基因（hpaP除外）的轉錄沒有影響。這說明hrcQ到hpaB基因同處一個轉錄單元中，而hrpD5基因的轉錄可能受到另外調控因子的作用。為了證實這個結果，本為從hrpC轉錄單

13、元的hpaP基因開始，以hrpE3基因為終點，以兩兩基因為對象，通過RT-PCR擴增發(fā)現(xiàn)，hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6、hrpE和hpaB基因處于同一轉錄單元中。這一結果不同于其它植物病原細菌黃單胞菌的轉錄單元構成，但與水稻白葉枯病菌的相應的轉錄單元相同。
　　 為了進一步說明HrpD6對hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的調控作用以及對hrpG和hrpX的轉錄表達有影響作用，

14、本研究將hpa2和hpa1的啟動子phpa2和phpa1以及phrcC、phrcT和phrpD51與gusA的融合構建，分別置于hrpD6突變體和野生型中，經(jīng)XOM3誘導表達后GUS活性檢測發(fā)現(xiàn)，HrpD6對hpa2、hpa1和hrcC基因以及hrpB轉錄單元有正調控作用，對hrpG、hrpX基因和hrpD轉錄單元轉錄表達沒有影響。
　　 為了蛋白質水平上檢測hrpD6突變后，影響了Hpa2和Hpa1的產(chǎn)生，本研究將hpa1和h

15、pa2基因與c-Myc標簽進行融合，分別置于野生菌株、T3S突變體hrcV突變體和hpaB突變體中。蛋白免疫雜交結果顯示，hrpD6突變體和hpaB突變體中無Hpa2和Hpa1蛋白的分泌。這說明，hpa2、hpa1和hpaB基因在轉錄水平上就受到了HrpD6的調控。為了進一步分析HrpD6對hpaB基因的調控作用，本研究以HpaB依賴而分泌的效應分子AvrXa27和不依賴HpaB而分泌的轉位元HrpF為報道基因，分別與FLAG和c-My

16、c進行融合，導入野生菌、T3S突變體hrcV、hrpD6和hpaB突變體中，經(jīng)過相同的誘導，蛋白質免疫雜交結果顯示，hrpD6突變后，與同hpaB突變體一樣，AvrXa27不分泌，HrpF仍能進行分泌。這表明，hrpD6基因突變后，hpaB基因不轉錄表達，從而AvrXa27不能進行分泌，而不依賴HpaB的HrpF能夠進行分泌。明確HrpD6是hrp-hrc-hpa基因的調控因子，在黃單胞菌的hrp基因調控中還屬首次報道。
　　

17、X.oryzae pv.oryzicola的hpa2基因位于hrp基因簇最左端，啟動子區(qū)域存在imperfect PIP-box，其基因產(chǎn)物屬lytic transglycosylase家族，推測其可能溶解植物細胞壁從而使T3SS發(fā)揮作用。hrpF基因位于hrp基因簇的右端，在寄主細胞膜上形成轉位裝置將效應蛋白轉運至寄主細胞中。Hpa2和HrpF是否互作，從而決定病原菌的致病性，還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，hpa2和hrpF基因分別突變后，降

18、低了在水稻上的毒性，細菌生長能力減弱，但不影響在非寄主煙草上的HR。 hpa2和hrpF同時突變后，X.oryzae pv.oryzicola在水稻上喪失了water soaking癥狀和致病性，但在非寄主上仍有HR激發(fā)能力。轉錄水平研究發(fā)現(xiàn)，hpa2基因的表達受HrpG調控，不受HrpX調控。細胞定位結果顯示，Hpa2作用于植物細胞膜上而非細胞壁。蛋白質互作和免疫雜交結果顯示，Hpa2通過T3SS進行分泌，并與HrpF互作，控制T3S

19、效應分子 AvrXa27轉位進入水稻細胞中，但在hrp誘導培養(yǎng)基上仍等檢測到AvrXa27的分泌，推測Hpa2和HrpF互作形成復合體，控制效應分子轉位進入植物細胞內，從而影響病原菌的致病性。
　　 水稻條斑病菌的HrpX能夠調節(jié)hrp基因的表達，而在被調節(jié)的因子啟動子區(qū)域一般含有PIP-box(plant-inducible promoter， TTCGC-N15-TTCGC)。為了研究HrpX對hpa1的調控機制，通過in

20、vivo策略，將啟動子區(qū)域含有PIP-box的hpa1基因啟動子分別與綠色熒光蛋白基因（green fluorescence protein，gfp）進行融合（phpa1::gfp），兩親交配導入水稻條斑病菌野生型菌株和hrpX突變體中，借助水稻懸浮細胞誘導表達系統(tǒng)，觀察啟動子啟動gfp的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，在hrpX基因突變體△RhrpX中，融合基因不轉錄表達，△RhrpX中菌體不顯示熒光。同時RT-PCR結果揭示，△RhrpX中hp

21、a1基因不能轉錄表達。以上結果表明，水稻條斑病菌中hpa1的轉錄表達受到HrpX的調控。
　　 水稻條斑病菌的hpa1是唯一已知的編碼Harpin的基因，但是其在引起細胞死亡的生理生化機制尚不清楚。為此，基于對Hpa1的氨基酸序列分析，本研究將Hpa1缺失互補喪失HR的雙突變體△Rhpa1△hrpF觀察HR，結果顯示Hpa1 N端的α-helix決定其在非寄主煙草上產(chǎn)生HR，且第47位(C)和第53位(L)氨基酸是關鍵氨基酸。通

22、過瞬時表達GFP，洋蔥表皮定位顯示Hpa1主要定位于細胞膜上，暗示其可能通過破壞植物細胞膜起作用。根據(jù)X.oryzae pv.oryzae中的AvrXa10和Xa10的特異性互作關系，同時以avrXa10為報道基因，將RS105 hpa1 N端60aa與缺失N端分泌信號(△28aa)的avrXa10融合后導入X.oryzae pv.oryzae PXO99A中，接種含有Xa10的水稻品種IRBB10觀察褐色抗病反應，結果表明Hpa1能經(jīng)

23、細菌T3S進行分泌，Western Blot泌出性檢測結果與此一致。這將為進一步揭示非寄主抗性提供更多的理論依據(jù)和有利線索。
　　 鑒于調控元件PIP-box序列保守性，可以將其作為一個有效的篩選標記從大量的基因組數(shù)據(jù)中獲得HrpX調節(jié)子?；蚪M信息提示，X.oryzae pv.oryzicola的很多基因在啟動子區(qū)域都含有完整或不完整的PIP-box。因此為了從X.oryzae pv.oryzicola中獲得更多受HrpX調節(jié)

24、的基因，本研究選取5個候選因子(hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234)借助啟動子-gfp（PIP-gfp）融合表達方法，導入X.oryzae pv.oryzicola hrpX基因突變體中，與水稻懸浮細胞互作后觀察熒光有無或強弱，建立了篩選HrpX調節(jié)子的體系，同時也提示某些含有imperfect PIP-box的因子如kgtP和Z1234也是HrpX調節(jié)子，這為新的Ⅲ型效應分子的發(fā)掘提供依據(jù)。
　　 鑒于X

25、.oryzae pv.oryzicola hpa1基因編碼產(chǎn)物Harpin具有在非寄主煙草上激發(fā)過敏反應的能力，其產(chǎn)物體外施用誘導植物產(chǎn)生多種有益表型，如抗病、抗蟲及促生等，而轉基因手段則可以實現(xiàn)其在植物體內的運用。為此，將水稻條斑病菌的hpa1放在組成型表達的CaMV35S啟動子下獲得重組質粒pBIhpa1。但Hpa1并沒有直接的殺菌活性，為此將Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋結構以及Melfin(ME)的α螺旋結構通過

26、polylinker以及自由環(huán)進行連接，獲得具有殺菌功能的融合基因hcm1。通過3種不同的構建策略將hcm1基因分別放在組成型表達的CaMV35S啟動子、受病原菌誘導表達的hsr203J和PR1a啟動子下獲得重組質粒pBIhcm1、pBIhshcm1和pBIPRhcm1。將上述轉基因重組質粒轉化根癌土壤桿菌EHA105菌株，通過農(nóng)桿菌介導的方法，進行水稻武粳15的成熟胚愈傷組織的轉化，獲得hpa1和hcm1轉基因水稻植株，能夠激活水稻防