水稻花藥發(fā)育控制基因OsADF的功能分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是最重要的糧食作物之一。水稻雄性不育與雜種優(yōu)勢的廣泛應用在農業(yè)生產上發(fā)揮了舉足輕重的作用。水稻產量和品質的形成與花器官發(fā)育直接相關，而花器官發(fā)育的分子遺傳機制是目前植物發(fā)育生物學的研究熱點之一。因此，闡明水稻花器官發(fā)育的分子遺傳機制具有重要意義。生殖發(fā)育過程中最重要的器官之一是花藥，在花藥發(fā)育過程中，絨氈層細胞經歷一個細胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)的過程來促進絨

2、氈層細胞的降解，以期為花粉外壁的形成以及花粉的發(fā)育提供必須的營養(yǎng)物質。但絨氈層細胞在整個小孢子發(fā)育過程中如何逐漸消亡以及如何參與到小孢子發(fā)育的分子機制并不清楚。
　　 前期曾分離到一個隱性核基因控制的水稻雄性不育突變體tdr(tapetum degradation retardation)，組織切片、透射電鏡等分析結果表明該突變體花藥絨氈層降解延遲，小孢子發(fā)育異常，最終導致雄性不育。利用圖位克隆技術分離到TDR基因，TDR基因編

3、碼一個bHLH(basic Helix Loop Helix)轉錄因子的核蛋白，并通過調控下游基因在水稻花藥絨氈層降解和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。目前已利用染色質免疫沉淀技術(ChIP)和ChIP-sequencing方法初步尋找到一批可能受到TDR調節(jié)的候選下游基因。其中OsADF基因(LOC_Os10g03660)是F-box蛋白家族成員。F-box蛋白是一類含有F-box結構域，在泛素介導的蛋白質水解過程中具有底物識別特性的蛋白質

4、家族。這類蛋白質在細胞循環(huán)、信號傳導、基因轉錄、雄性不育和細胞程序性死亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用定量ChIP-PCR技術等分析方法對OsADF基因進行分離篩選驗證并對其功能及表達模式進行深入研究，主要結果如下：
　　 1.定量ChIP-PCR、凝膠遷移率實驗(EMSA)結果驗證了OsADF基因受TDR直接調控。另外，OsADF本身在tdr突變體中沒有表達，利用TDR的啟動子在tdr突變體中表達OsADF，結果顯示

5、，TDR啟動子可以啟動OsADF基因的表達，此結果進一步驗證TDR對OsADF基因的調控作用。
　　 2.生物信息分析結果表明OsADF基因是F-Box蛋白家族。在日本晴中過量表達OsADF基因，獲得的陽性轉基因植株出現育性下降的表型。通過RNAi干擾技術降低OsADF基因在水稻中的表達水平，可以檢測到轉基因植株不同程度的出現不育的表型，并且通過半薄切片分析發(fā)現花粉發(fā)育的后期絨粘層細胞異常膨大，不能進行正常的PCD降解，最終影響

6、花粉發(fā)育，從而導致雄性不育，其表型與tdr突變體的表型基本一致。RT-PCR以及qRT-PCR檢測結果表明OsADF在干擾植株中表達量明顯下降，這一結果說明目的基因的正常表達對水稻花粉的形成起著非常重要的作用。
　　 3.RT-PCR、OsADF啟動子與報告基因Gus融合表達以及原位雜交結果表明，從花藥發(fā)育第9期到第12期，OsADF基因在絨氈層和小孢子中特異表達。亞細胞定位研究表明OsADF蛋白定位在細胞膜上，該基因在細胞核中