水稻新型CBF轉(zhuǎn)錄因子基因OsCBF1的克隆、表達(dá)和表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、在我國北方地區(qū)，低溫、鹽分和干旱等非生物逆境在作物生長期間普遍發(fā)生。提高作物對(duì)上述逆境的抵御能力，對(duì)我國北方地區(qū)作物生產(chǎn)水平的提高具有重要意義。研究表明，在低溫、鹽分和干旱等逆境條件下，通過逆境信號(hào)在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及應(yīng)答和抵御基因的有序表達(dá)，植物本身通常對(duì)上述逆境產(chǎn)生迅速應(yīng)答和一定程度的抵御能力。其中，CBF類轉(zhuǎn)錄因子在增強(qiáng)植物抵御上述逆境的能力中具有重要作用。 本項(xiàng)研究在克隆新型水稻CBF類轉(zhuǎn)錄因子基因(OsCBF1)的基礎(chǔ)上

2、，較全面闡明了OsCBF1的表達(dá)調(diào)控特性，構(gòu)建了分別融合OsCBF1編碼閱讀框和啟動(dòng)子區(qū)的植物雙元表達(dá)載體，為進(jìn)一步揭示該基因的功能和表達(dá)調(diào)控特征奠定了理論基礎(chǔ)。 主要結(jié)果如下： 1、在國際生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)了尚未進(jìn)行特征分析和功能報(bào)道的推定CBF轉(zhuǎn)錄因子的基因(GenBank登陸號(hào)：NP_910360)。本研究將其命名為OsCBF1。以臺(tái)北309水稻品種的DNA為模板，擴(kuò)增出該基因全長。

3、 2、OsCBF1全長772bp，其中開放閱讀框(ORF)為645 bp，5'與3'端的非編碼區(qū)分別為27 bp和100 bp。在基因組水平上，OsCBF1不含有內(nèi)含子。OsCBF1編碼214個(gè)氨基酸殘基，分子量為23.5 KD。含有轉(zhuǎn)錄因子共有的核定位信號(hào)區(qū)、DNA．結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。 3、在正常、低溫、鹽分和干旱處理中，對(duì)OsCBF1及其同源的8個(gè)未研究報(bào)道的水稻CBF基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。其中檢測到OsCBF1、CB

4、FI-like、RCBF3、unnamel和unname6的轉(zhuǎn)錄本，其它基因的轉(zhuǎn)錄本未能被檢測到。后者的轉(zhuǎn)錄本未能被檢測可能是由于上述基因在試驗(yàn)條件下不表達(dá)，或表達(dá)豐度低于本研究檢測范圍以及引物設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步優(yōu)化有關(guān)。 4、OsCBF1的表達(dá)在正常生長(CK)和低溫處理下表現(xiàn)為根特異性。CBFI-like、unnamed1和unnamed6在根中的表達(dá)表現(xiàn)為低溫誘導(dǎo)特性，其中，CBFI-like和unnamed6表現(xiàn)為誘導(dǎo)增強(qiáng)特

5、性，低溫處理2 h后，轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較對(duì)照顯著增多，以后至4 h較2 h時(shí)有所降低(CBF1-like)或繼續(xù)增大(unnamed6)，但均高于CK：unnamed1的表達(dá)表現(xiàn)為低溫誘導(dǎo)特征，且隨著低溫處理時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量迅速增多。表明，OsCBF1、unnanmcd1和unnamed6等CBF轉(zhuǎn)錄因子在介導(dǎo)水稻的低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能具有較重要作用。 5、在鹽分脅迫3 h后，OsCBFI、CBFI-like、RCBF3和unn

6、amed6根中的轉(zhuǎn)錄本均較對(duì)照增多，其中，以O(shè)sCBFI和unnamed6轉(zhuǎn)錄本的增加幅度較大，表明上述基因可能參與了鹽分逆境信號(hào)在根中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述基因在葉中的表達(dá)與根中有所不同，其中，OsCBFI在對(duì)照和各鹽分處理下均不表達(dá)，CBFI-like表現(xiàn)為鹽分誘導(dǎo)特性，RCBF3受到鹽分調(diào)控的效應(yīng)較小。而unnamed6呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。表明不同CBF基因在植株不同器官中介導(dǎo)鹽分逆境信號(hào)的能力和機(jī)制存在差異。 6、干旱脅迫后3 h對(duì)根

7、中OsCBF1、CBF1-like、RCBF3、unnamedl和unnamed6的表達(dá)水平?jīng)]有影響；干旱處理對(duì)OsCBF1、CBF1-like和unnamed1在葉中表達(dá)的影響也較小，但使RCBF3和unnamed6的表達(dá)水平明顯降低。表明RCBF3和unnamed6基因可能以負(fù)向調(diào)節(jié)的方式參與了葉中的干旱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 7、采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了將OsCBF1編碼閱讀框(OKF)正確插入至表達(dá)載體pCAMBIA1305相應(yīng)位點(diǎn)的

8、植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1305-OsCBF1。并將此雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后獲得陽性克隆。為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化植株，鑒定OsCBF1的功能奠定了基礎(chǔ)。 8、用水稻TP309 DNA為模板，根據(jù)OsCBF1 5側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)序列擴(kuò)增了OsCBF1的啟動(dòng)子。分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子含有多個(gè)參與調(diào)控下游基因的調(diào)控元件。采用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了將OsCBF1啟動(dòng)子正確插入至表達(dá)載體pCAMBIA1305相應(yīng)位點(diǎn)的植物雙元表達(dá)載體p