1、自噬在鎘致大鼠神經(jīng)細胞毒性中的作用及調(diào)控機制Theroleandregulationmechanismofautophagyinrat’Sneuronsinjuredbycadmium研究生:王棋文導(dǎo)師:劉宗平教授學(xué)科專業(yè):臨床獸醫(yī)學(xué)資助項目:國家自然科學(xué)基金(31101866。31302058)揚州大學(xué)2014年6月?lián)P州大學(xué)博士學(xué)位論文數(shù)陽性細胞,處理組與對照組差異極顯著(pO01);吖啶橙染色表明,正常細胞顯示了較少的紅色熒光,經(jīng)鎘
2、處理后的細胞內(nèi)紅色熒光強度明顯增加;MDC染色揭示,對照組MDC熒光較弱,20gmol/L鎘處理4h,MDC熒光信號逐漸增強,并有熒光積聚斑點;透射電鏡結(jié)果表明,20gmol/L鎘處理4h,兩種細胞出現(xiàn)了典型的自噬體,處理24h,染色質(zhì)開始在核周邊積聚,胞質(zhì)空泡化。提示鎘可以誘導(dǎo)兩種細胞發(fā)生自噬和凋亡。3啟噬在鎘致神經(jīng)細胞損傷中的作用為了揭示自噬在鎘致神經(jīng)細胞毒性損傷中的作用,本研究利用鎘單獨或聯(lián)合自噬的特異性抑制劑羥氯喹(CQ)作用4
3、h,或聯(lián)合誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAP)作用24h,對PC12細胞和原代神經(jīng)細胞LC3表達的影響,MTT法測定了CQ和RAP對兩種細胞活性的影響。結(jié)果表明,聯(lián)合應(yīng)用CQ,與4h鎘處理組比較,兩種細胞LC3II的蛋白表達量顯著上升(p005),但細胞活力都有明顯下降(p005或P001);聯(lián)合應(yīng)用RAP作用24h,與24h鎘處理組比較,兩種細胞LC3II的蛋白表達量顯著上調(diào)(p005或PO01),同時細胞活力顯著上升(p005或P001)。表明
4、自噬在鎘引起的細胞損傷中起保護作用。4鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬和凋亡的關(guān)系為了探討鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬與凋亡的相互關(guān)系,本研究利用鎘單獨或聯(lián)合CQ作用4h,或聯(lián)合RAP或caspase抑制劑ZVADfmk作用24h,流式細胞術(shù)檢測PC12細胞凋亡率的變化,DAPI熒光染色觀察原代神經(jīng)細胞細胞核的變化。結(jié)果表明:與對照組比較,鎘作用24h,PC12細胞凋亡率從45%增加到458%,差異性極顯著(p001),鎘聯(lián)合caspase抑制劑ZVADfmk
5、作用24h,細胞凋亡率明顯降低,與鎘24h比較,差異性極顯著(p001),進一步說明鎘可以誘導(dǎo)PC12細胞發(fā)生凋亡。與鎘4h組比較,鎘聯(lián)合CQ作用4h,細胞凋亡率111%增加到337%,差異性極顯著(pO01);與鎘24h組對比,鎘聯(lián)合RAP作用24h,凋亡率從458%降至147%,差異性極顯著(PO01)。與正常原代神經(jīng)細胞比較,20gmol/L鎘處理24h組出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、核碎裂:鎘聯(lián)合CQ作用4h,損傷的細胞增多,出現(xiàn)新月狀、濃縮
6、的胞核,甚至出現(xiàn)核碎裂;而鎘聯(lián)合RAP或ZVADfmk組,細胞的損傷明顯減輕。說明鎘誘導(dǎo)的自噬可以延遲凋亡的發(fā)生。5classIIIP13K/Beclin1/Bcl一2通路在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬中的作用為研究classIIIP13K/Beclin1/Bcl2通路在自噬中的作用,20gmol/L鎘分別作用PC12和原代神經(jīng)細胞0、2、4、6、8、12、24h,免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達,加入P13K抑制劑LY2940026h后,觀察相關(guān)蛋