miRNA-17-92基因簇在肺腺癌多藥耐藥中作用的初步研究.pdf

1、【背景】
　　肺癌是全球范圍內發(fā)病率及死亡率極高的惡性腫瘤之一，其中約80％為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），在我國，約70%-80%的患者在確診時已為中晚期，失去了手術機會。因此，化學藥物治療成為中晚期NSCLC患者治療的主要手段。盡管新研發(fā)的藥物層出不窮，患者的5年生存率僅為10%-15%，最重要的一個原因就是肺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥（multidrug resista

2、nce，MDR）。研究表明，非小細胞肺癌的多藥耐藥是一個多通道參與、多因素影響及多種蛋白介導的復雜過程。近年來，隨著基因組學及蛋白組學研究手段的不斷發(fā)展，越來越多的肺癌耐藥分子被發(fā)現(xiàn)，然而，肺癌MDR的分子機制尚未完全闡明。
　　MicroRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動植物體內的內源性非編碼的單鏈小分子RNA,長度為19-25nt。miRNA主要通過在轉錄后水平與特異的靶mRNA的3＇UTRs（untrans

3、lated regions）結合使之降解或者抑制其翻譯,從而調控相關靶基因的表達。目前已經(jīng)鑒定的人類基因組中的miRNA數(shù)目已超過1000個。隨著對miRNA功能研究的深入,越來越多的研究成果發(fā)現(xiàn)，miRNA可能在調控細胞增殖、分化、凋亡等方面起重要作用，并且在人類腫瘤形成及調節(jié)腫瘤耐藥性方面也扮演者重要角色。因此，我們推測：miRNA可能參與某些耐藥基因及蛋白表達的調控，進而影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。目前為止，mir-17-92

4、基因簇在NSCLC多藥耐藥中的作用及機制尚未見報道。
　　【目的】
　　探討miR-17-92家族成員miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a在非小細胞肺癌MDR中的調節(jié)作用及分子機制，進而更全面地闡明肺癌耐藥機制，為逆轉腫瘤細胞耐藥提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.利用Real time RT-PCR對miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR

5、-106a的芯片結果進行驗證；
　　2.通過細胞轉染，用miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的寡核苷酸模擬物分別上調A549/DDP中miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達，miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR–106a特異的反義寡核苷酸抑制物分別下調 A549細胞的mir-17/miR-20a/miR-20b/

6、miR-92b/miR-106a的表達；并檢測其轉染效率。
　　3.通過CCK8實驗分別檢測miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a對肺癌細胞耐藥株A549/DDP及非耐藥株A549體外藥物敏感性的影響，同時篩選出能影響藥物敏感性的microRNA。
　　4.通過CCK8實驗分別檢測 miR-92b對化療藥物DDP、VP-16、VCR、ADM及5-FU的多藥耐藥效應。
　　5.通過

7、生物信息學網(wǎng)站或軟件預測miR-92b調控的靶基因。
　　6.利用RT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-92b調控的靶基因；
　　【結果】
　　1.Real-time PCR結果顯示: miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達在耐藥株細胞A549/DDP較非耐藥株細胞A549中顯著降低，與芯片結果相符合。
　　2.體外藥物敏感性試驗表

8、明，上調miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達，A549/DDP細胞對DDP的敏感性顯著增加，而下調miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達后，只有miR-92b可降低A549細胞對DDP的敏感性。
　　3.因此，我們選擇miR-92b做為我們研究的microRNA，通過生物信息學預測，從miR-92b調控的眾多靶基因中，挑選出DNA損傷修復

9、基因RAD21及REV3L作為研究的靶基因。
　　4.與對照細胞相比，轉染miR-92b核苷酸模擬物的A549/DDP細胞的RAD21及REV3L mRNA,但蛋白水平未見明顯減低。轉染miR-92b反義寡核苷酸抑制物的A549細胞的RAD21及REV3L mRNA及RAD21的蛋白水平均表達上調,miR-92b通過結合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的RAD21及REV3L3’UTR的靶位點，抑制熒光素酶表達，而使靶點序列突變后可解