microRNA在胃癌多藥耐藥中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、【背景】
　　胃癌細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）是導(dǎo)致胃癌患者化療失敗的最主要原因。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，目前已明確胃癌MDR是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段的飛速發(fā)展，新的胃癌耐藥相關(guān)分子不斷得以發(fā)現(xiàn)，然而胃癌MDR的分子機(jī)制仍未完全闡明。值得思考的是，目前的研究大多熱衷于挖掘耐藥與親本/藥敏細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因，進(jìn)而探究其介導(dǎo)耐藥的下游分子通路，而忽略了導(dǎo)致諸

2、多基因差異表達(dá)的幕后操縱者，即這些耐藥相關(guān)基因的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是研究中的盲點(diǎn)。如果逆向探尋上游的調(diào)節(jié)分子，找到處于耐藥分子網(wǎng)絡(luò)中的“始作俑者”，將其作為靶點(diǎn)來(lái)逆轉(zhuǎn)胃癌MDR，將為胃癌化療開(kāi)辟新的道路。
　　microRNA(miRNA)是近年來(lái)得以發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。據(jù)預(yù)測(cè)，每個(gè)miRNA可以調(diào)控大約200個(gè)基因的表達(dá)，存在于人體內(nèi)的大約1000個(gè)miRNAs可調(diào)控超過(guò)1/

3、3的蛋白編碼基因的表達(dá)，影響著幾乎所有的信號(hào)通路。miRNA已被證實(shí)廣泛參與多種生理病理過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。由此，我們推測(cè)：miRNA可能是我們要尋找的一類處于胃癌耐藥分子網(wǎng)絡(luò)上游的調(diào)節(jié)分子，調(diào)控眾多耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的耐藥表型。目前為止，miRNA在胃癌MDR中的作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　【目的】
　　探討miRNA在胃癌MDR中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，以期更全面的闡明胃癌MDR機(jī)制，并為尋找新

4、的耐藥逆轉(zhuǎn)策略提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和其親本細(xì)胞SGC7901的miRNA表達(dá)譜，找出差異表達(dá)的miRNA；2.利用real-timeRT-PCR法對(duì)miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；3.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，利用miR-15b/miR-16/let-7a特異的前體寡核苷酸分別上調(diào)SGC7901/VCR細(xì)胞中miR-15b/miR-16/let-7a的表達(dá)，miR

5、-15b/miR-16/let-7a特異的反義寡核苷酸抑制物分別下調(diào)SGC7901細(xì)胞中miR-15b/miR-16/let-7a的表達(dá)；4.通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)miR-15b/miR-16/let-7a對(duì)胃癌細(xì)胞(SGC7901、SGC7901/VCR)體外藥物敏感性的影響；5.通過(guò)小鼠腎包膜下移植法(SRCA)檢測(cè)miR-15b/miR-16/let-7a對(duì)胃癌細(xì)胞(SGC7901/VCR)體內(nèi)藥物敏感性的影響；6.利用生物信息學(xué)網(wǎng)站

6、或軟件預(yù)測(cè)miR-15b/miR-16/let-7a可能調(diào)控的靶基因；7.利用Westernblot、RT-PCR以及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-15b/miR-16/let-7a調(diào)控的靶基因；8.通過(guò)AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和caspase-3/7活性試驗(yàn)分析miR-15b/miR-16對(duì)胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR的凋亡敏感性的影響；9.借助宿主細(xì)胞再活化試驗(yàn)分析let-7a對(duì)胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901

7、/VCR的DNA損傷修復(fù)能力的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.12個(gè)miRNAs在胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和其親本細(xì)胞SGC7901中差異表達(dá)（＞2倍），在SGC7901/VCR細(xì)胞中表達(dá)升高的miRNAs為miR-302b和miR-492，表達(dá)降低的miRNAs為let-7a、miR-15b、miR-16、miR-17-5p、miR-20a、miR-23b、miR-106a、miR-106b、miR-196a和

8、miR-320。其中一些miRNAs已報(bào)道與腫瘤相關(guān)，即‘oncomir’，而與胃癌多藥耐藥的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道；2.real-timeRT-PCR結(jié)果顯示：miR-15b、miR-16和let-7a的表達(dá)在SGC7901/VCR細(xì)胞較SGC7901細(xì)胞中顯著降低，與芯片結(jié)果一致；3.體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-15b/miR-16/let-7a的表達(dá)，SGC7901/VCR細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性顯著增加，而下調(diào)miR-15b/m

9、iR-16/let-7a的表達(dá)可顯著降低SGC7901細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性；4.SRCA體內(nèi)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)miR-15b/miR-16/let-7a的表達(dá)可顯著增強(qiáng)SGC7901/VCR細(xì)胞體內(nèi)對(duì)順鉑的敏感性；5.miR-15b和miR-16屬于同一miRNA家族，具有結(jié)構(gòu)上的同源性，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的眾多miR-15b和miR-16的靶基因中包括已明確的耐藥相關(guān)分子Bcl-2，而let-7a的預(yù)測(cè)靶基因中包括已明確的耐藥

10、相關(guān)分子Ras；6.與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-15b/miR-16特異前體的SGC7901/VCR細(xì)胞的Bcl-2蛋白水平明顯降低，而mRNA水平則無(wú)顯著差異。miR-15b/miR-16通過(guò)結(jié)合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的Bcl-23’UTR的靶位點(diǎn)，抑制熒光素酶表達(dá)，破壞該靶位點(diǎn)可以解除miR-15b/miR-16對(duì)熒光素酶表達(dá)的抑制效應(yīng)；7.與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染let-7a反義抑制物的SGC7901細(xì)胞的H-Ras蛋白水平明顯

11、升高，而mRNA水平則無(wú)顯著差異。let-7a通過(guò)結(jié)合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的H-Ras3’UTR的靶位點(diǎn)，抑制熒光素酶表達(dá)。8.AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)、caspase-3/7活性試驗(yàn)的結(jié)果顯示：與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-15b/miR-16特異前體的SGC7901/VCR細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性顯著增加；9.宿主細(xì)胞再活化試驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染let-7a特異前體的SGC7901/VCR細(xì)胞的

12、DNA損傷修復(fù)能力顯著降低。
　　【結(jié)論】
　　1.miRNA在胃癌多藥耐藥細(xì)胞和其親本細(xì)胞中差異表達(dá)，可能參與胃癌多藥耐藥的發(fā)生；2.miR-15b，miR-16參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞多藥耐藥表型，其可能的分子機(jī)制是：miR-15b、miR-16負(fù)性調(diào)控靶基因Bcl-2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性；3.let-7a參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞多藥耐藥表型，其可能的分子機(jī)制是：let-7a負(fù)性調(diào)控靶基因Ras的表達(dá)，