胎血間充質干細胞移植對腦缺血大鼠治療作用研究.pdf

1、目的：間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是不同于造血基質細胞的干細胞群，具有多分化潛能，是骨髓基質、骨、軟骨、肌肉、腱、脂肪和結締組織細胞的前體細胞。已有報道，MSCs存在于骨髓、外周血、臍血等。已證實骨髓間質細胞具有在特定條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)細胞的能力。Oscar等將人臍血來源的MSCs誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)細胞。與之相比，Mareschi等通過細胞化學和分子生物學法證明

2、骨髓MSCs分化成成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，而臍血細胞不能分化且很快死亡。因此，臍血來源MSCs有無此分化能力存在爭議。已有研究神經(jīng)移植可促進缺血大腦的再生，胎兒神經(jīng)干細胞能減輕腦損傷的動物和人的行為缺陷，但胚胎移植受倫理限制。MSCs已用于嚴重成骨不全和癌癥患者的細胞治療和基因治療，對于治療其它疾病的研究也相繼展開。MSCs植入正常大鼠腦后能分泌神經(jīng)因子，成為神經(jīng)膠質。另外，骨髓細胞靜脈注射給大腦中動脈栓塞(middle cere

3、bral artery occlusion，MCAO)大鼠，可穿過血腦屏障到達缺血部位并分化成少量星型膠質細胞。全骨髓細胞和體外培養(yǎng)的MSCs腦內(nèi)移植入MCAO 1天的大鼠和小鼠，可表達神經(jīng)細胞表型并促經(jīng)功能恢復。但骨髓干細胞的分化增殖能力會隨年齡增加而降低，因此有必要尋找其它來源的干細胞。關于臍血MSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存活生長的研究很少。因此本研究擬探索大鼠胎血MSCs的分離擴增，誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞的培養(yǎng)條件；M

4、SCs經(jīng)尾靜脈移植入MCAO的大鼠后觀察其神經(jīng)功能恢復及植入細胞的存活、遷移和向神經(jīng)細胞分化的情況，為臍血干細胞治療人類缺血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供實驗依據(jù)。 方法：1．MSCs的體外培養(yǎng)無菌條件下，取孕20天大鼠的胎血至含肝素30U/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液中。密度梯度離心法收獲單個核細胞(monorluclear cells，MNCs)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate bufferedsaline，PBS)洗滌后接種于含10

5、％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。1周后棄掉未貼壁細胞，以后每周換液2次。擴增MSCs的鑒定：α-丁酸萘酚酯酶(α-naphthol butyric acid esterase，NBE)、鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)兩種細胞化學染色；流式細胞儀檢測MSCs免疫表型CD44、CD54、CDIIb、CD45的表

6、達情況。 2．MSCs的誘導分化及鑒定 (1)向成骨細胞分化第5代MSCs，種植于含有0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ一甘油磷酸和0.2mmol/L抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)液。細胞化學染色茜素紅、堿性磷酸酶檢測。 (2)向脂肪細胞分化第5代MSCs，種植于含1 μmol/L氫化考的松、0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(3-isobutyl—l—methylxanthine，IBMX)、0.1mm

7、ol/L消炎痛和10％兔血清的DMEM培養(yǎng)液。油紅O染色檢測脂肪細胞的形成。 (3)向神經(jīng)細胞分化 以β-巰基乙醇(β—mercaptoethanol，β—ME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、叔丁基對羥基茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)定向誘導擴增第5代的MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，免疫細胞化學法鑒定神經(jīng)細胞標志物巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(ne

8、uron—specific enolase，NSE)、神經(jīng)膠原纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)的表達。 3．MCAO模型的建立和細胞移植 5溴-2脫氧尿核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標記備用的MSCs，移植前流式細胞儀檢測BrdU標記率、臺盼藍排斥實驗檢測MSCs活性。30只雄性成年大鼠MCAO模型分組：移植組通過尾靜脈每只大鼠注射含6×10

9、<'6>個MSCs的生理鹽水1ml；生理鹽水組注射等量生理鹽水；手術組不作任何處理。手術后1、7、14、21、28天采用改良神經(jīng)功能損害評分(modified neurological severity score，mNSS)對大鼠進行行為學檢查；組織學檢測肝、腎、脾有無免疫排斥反應；免疫組織化學雙染技術檢測腦組織切片中BrdU標記的MSCs的存活、遷移及其Nestin、GFAP和NSE的表達。 結果：1．MSCs體外培養(yǎng)及鑒定

10、 大鼠胎血中存在MSCs且可大量擴增，呈成纖維細胞樣生長。細胞化學染色示其NBE陽性，ALP陰性，流式細胞儀檢測顯示MSCs表達CD44、CD54，不表達CD11b、CD45。 2．誘導分化及鑒定 (1)向成骨細胞分化原來梭形MSCs逐漸變寬、平，誘導2周后，茜素紅染色證實細胞內(nèi)有鈣沉積，堿性磷酸酶染色陽性。 (2)向脂肪細胞分化誘導1周后，MSCs可見有脂滴形成，油紅染色陽性。 (3)向神經(jīng)細

11、胞分化誘導后MSCs形態(tài)學觀察類似于神經(jīng)元，免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)其Nestin和NSE陽性，GFAP陰性。 3．MCAO模型的建立和細胞移植 MSCs移植前，流式細胞儀檢測BrdtJ標記率為93％，臺盼藍排斥實驗檢測MSCs活細胞率是97.8％。MCAOl4天以后，MSCs移植組大鼠比對照組的神經(jīng)功能恢復顯著(P<0.05)。肝、腎、脾組織結構無異常、無免疫排斥反應。移植的MSCs細胞可在大鼠腦組織中存活，并向缺血區(qū)域遷移

12、，BrdU陽性細胞中(2.88±0.76)％表達Nestin，(5.24±1.06)％表達GFAP，(1.34±1.29)％表達NSE。 結論：大鼠胎血能夠分離、擴增培養(yǎng)出豐富MSCs，在適當條件下可向成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化。體外擴增純化后的MSCs可促進局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復，移植細胞可在大鼠腦缺血區(qū)域中存活、遷移并向神經(jīng)干細胞、星形膠質細胞和神經(jīng)元分化。胎血MSCs具有擴增能力強、方便易得、無