骨髓間充質干細胞腦內移植對錳中毒大鼠治療作用研究.pdf

1、目的：⑴探索最合適的錳中毒大鼠模型建立條件，并采用判別分析方法得到通用公式，篩選造模成功的大鼠為治療對象；⑵對造模成功的錳中毒大鼠進行腦內移植骨髓間充質干細胞，觀察移植后細胞生長分化情況；⑶通過檢測多巴胺含量及路易小體相關成分的改變等觀察骨髓間充質干細胞治療效果。
　　方法：①選用SPF級健康雄性SD大鼠24只，隨機分為對照組、低劑量組(15mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)和高劑量組(50mg/kg)，腹腔注射MnCl2·

2、4H2O，每48h/次，每隔一個月對所有大鼠進行行為學評分、肌張力改變、平衡木試驗、水迷宮實驗4項行為學測試，待大鼠出現(xiàn)明顯行為改變時停止染毒，并檢測其大腦紋狀體酪氨酸羥化酶(TyrosineHydroxylase，TH)含量，探索最合適的造模條件（染毒劑量和時間），并以對照組大鼠TH平均水平的30％為界劃分成錳中毒組和非錳中毒組，通過4項行為學指標聯(lián)合建立判別分析函數(shù)，以便對下一步實驗中的染毒大鼠進行判斷。②按上述方法的最合適造模條件

3、對30只SD大鼠染錳，測試其行為學改變并記錄各項行為學評分、肌張力評分等，按照造模時得出的判別公式，對每一只染毒大鼠進行判別。將所有符合錳中毒大鼠標準的大鼠挑選出來，隨機分成空白對照組、骨髓間充質干細胞(Bone marrow stromal cell，BMSCs)治療組和PBS對照組，對BMSCs治療組采用大腦立體定位法精準注射BMSCs，PBS對照組注射PBS，空白對照組不做任何處理。一月后測試大鼠行為學改變，并檢測紋狀體內多巴胺(

4、dopamine，DA)含量，免疫熒光觀察移植的干細胞生長、遷移和分化情況，western blot檢測路易小體主要成分α-syn和NF-L的含量，透射電鏡觀察其超微結構改變。
　　結果：⑴造模條件探索結果:高劑量組大鼠死亡一只，采用行為學評分、肌張力評分、平衡木測試及水迷宮實驗多項行為學評分來評估23只染錳大鼠的行為學改變，綜合測評大鼠的染毒效果。對照組大鼠三個月的各項行為學測試均為陰性，低劑量組行為學雖有改變但和對照組相比差異

5、有統(tǒng)計學意義的較少，高劑量組和中劑量組出現(xiàn)行為改變的時間更短并且在染毒三個月的時間點上各項行為學改變差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。根據(jù)TH的表達，高劑量組造模成功率為100％，中劑量組成功率為66.67％。由于高劑量組實驗過程中出現(xiàn)動物死亡情況，綜合評價得出采用25mg/kgBW濃度腹腔注射MnCl2·4H2O三個月為最佳造模條件。⑵判別分析結果:將對照組大鼠TH表達平均值作為正常水平，TH表達若低于正常水平的30％則為錳中毒模型

6、，由此將所有大鼠分為非錳中毒組和錳中毒。兩組大鼠各項行為學評分結果，錳中毒組大鼠行為學評分均高于非錳中毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。以行為學指標全部作為自變量，以TH作為因變量納入判別方程。Fisher判別法得到函數(shù):錳中毒大鼠:Y=-31.830+8.867x1-4.995x2+9.862x3+0.952x4+8.877x5。非錳中毒大鼠:Y=-22.831+2.792x1-3.318x2+7.043x3+0.874x4+8

7、.241x5，其中x1-x5分別代表肌張力評分結果、平衡木評分結果、行為學評分結果、水迷宮逃避潛伏期、水迷宮平臺搜索次數(shù)。將大鼠的各指標分別帶入上述兩組函數(shù)中求出判別函數(shù)值，哪個函數(shù)值更大，則該只大鼠即屬于哪個組。符合率為為95.7％(22/23)，誤判率為4.3％(1/23);該判別函數(shù)對非錳中毒大鼠和錳中毒大鼠的正確判別符合率分別是92.3％(12/13)和100％(10/10)。⑶骨髓間充質干細胞移植后行為學改變和理化指標觀察:3

8、0只染錳大鼠中經(jīng)過判別公式得出19只符合錳中毒標準，此次造模成功率為63.3％。移植手術后，大鼠生長情況良好，無感染或其他副反應出現(xiàn)，一周左右大鼠的頭部皮膚完全愈合。治療前后三組大鼠行為學評分、肌張力評分、平衡木試驗差異均無統(tǒng)計學意義。治療后三組大鼠紋狀體內DA含量差異有統(tǒng)計學意義(F=5.376，P=0.016)，BMSCs治療組紋狀體DA含量高于對照組(P＜0.01)。免疫熒光可見兩組均有TH陽性細胞，但BMSCs治療組TH陽性明顯

9、比PBS對照組多，說明兩組都有DA神經(jīng)元存在且BMSCs治療組DA神經(jīng)元比PBS對照組多。BMSCs治療組可以看到聚集的H-Nuc表達，少數(shù)開始擴散，并隨著腦脊液進入各腦室，說明外源BMSCs在大鼠大腦中可以存活至少一月，并能夠遷移至其他區(qū)域。BMSCs治療組有TH與H-Nuc雙標陽性細胞，PBS對照組無雙標陽性細胞。說明人源BMSCs移植入SD大鼠大腦后可成功分化為DA能神經(jīng)元。PBS對照組同空白對照組差異不明顯。Western bl

10、ot顯示BMSCs移植治療后路易小體主要成分α-syn表達相比對照組減少而NF-L的含量增多。⑷骨髓間充質干細胞移植后病理改變觀察:電鏡下，可以看到空白對照組的大鼠紋狀體內較多神經(jīng)元周圍空泡、核周池擴張，核固縮、染色質聚集，膠質細胞出現(xiàn)染色質聚集現(xiàn)象。說明錳中毒大鼠紋狀體神經(jīng)元損傷和凋亡現(xiàn)象嚴重。神經(jīng)元內還可見多處蛋白質聚集且部分蛋白質聚集物與溶酶體融合，髓鞘內可見神經(jīng)絲異常。BMSCs治療組可見較多紋狀體神經(jīng)元核膜呈圓形或橢圓形，具有