KLF5在AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）在血管損傷因素刺激下可發(fā)生表型轉(zhuǎn)換而獲得增殖能力。VSMC增殖是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的共同細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。闡明VSMC增殖的發(fā)生機(jī)制，對(duì)防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。
　　 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）不僅具有調(diào)節(jié)血管舒縮功能的活性，而且在VSMC增殖中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，AngⅡ通過(guò)與細(xì)胞膜上相應(yīng)的AngⅡ受體結(jié)合而激活多條信號(hào)途徑，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和

2、相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)VSMC表型和功能。研究AngⅡ調(diào)節(jié)促增殖基因的表達(dá)和促進(jìn)VSMC增殖的作用機(jī)制，有助于闡明血管增殖性疾病發(fā)生的分子機(jī)制。
　　 為了闡明KLF5在AngⅡ調(diào)節(jié)cyclin D1基因表達(dá)及促進(jìn)VSMC增殖中的作用，本文在系統(tǒng)觀察AngⅡ?qū)SMC增殖、遷移活性影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了KLF5在介導(dǎo)AngⅡ促增殖中的作用和分子機(jī)制。旨在為揭示動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)

3、和理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供特異性藥物靶點(diǎn)。
　　 1.AngⅡ?qū)SMC增殖和遷移的影響
　　 利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析等方法，觀察AngⅡ?qū)SMC增殖及遷移活性、細(xì)胞周期進(jìn)程、分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。結(jié)果如下：
　　 1.1 AngⅡ?qū)SMC生物學(xué)行為的影響
　　 MTT分析、流式細(xì)胞術(shù)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度（10-8、10-7、10-6M）的A

4、ngⅡ處理細(xì)胞不同時(shí)間（3、6、12、24、48 h）后，可明顯增加VSMC增殖和遷移活性，而且具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 1.2 AngⅡ?qū)SMC分化標(biāo)志基因SM22α和增殖標(biāo)志基因PCNA表達(dá)的影響
　　 結(jié)果顯示，在AngⅡ處理的細(xì)胞中，分化標(biāo)志基因SM22αmRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而增殖標(biāo)志基因PCNA表達(dá)活性則顯著升高，具有明顯的時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)。結(jié)果提示，AngⅡ是VSMC的促增殖

5、因子。
　　 2.KLF5在AngⅡ誘導(dǎo)的cyclin D1表達(dá)及VSMC增殖中的作用
　　 眾多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子KLF5是一個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡調(diào)節(jié)密切相關(guān)的基因，在VSMC增殖及血管病變形成過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。本部分研究觀察了AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖過(guò)程中KLF5和cyclin D1的表達(dá)變化及二者之間的關(guān)系。
　　 2.1 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的VSMC cyclin D1和KLF5表達(dá)的影響

6、>　　 RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，AngⅡ可顯著誘導(dǎo)KLF5和cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并具有明顯的時(shí)-效（3、6、12、24、48 h）和量-效（10-8、10-7、10-6M）關(guān)系。細(xì)胞免疫化學(xué)分析顯示，在AngⅡ處理的VSMC中，KLF5陽(yáng)性染色顆粒明顯增多，且主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。
　　 2.2 KLF5過(guò)表達(dá)對(duì)VSMC cyclin D1表達(dá)和VSMC增殖及遷移活性的影響
　　

7、 以KLF5腺病毒表達(dá)載體Ad-KLF5感染VSMC48 h，經(jīng)Western blot分析和細(xì)胞免疫化學(xué)染色證實(shí)，外源性KLF5在VSMC中高效表達(dá)。在Ad-KLF5感染的VSMC中，cyclin D1的表達(dá)活性也明顯升高，與KLF5的變化趨勢(shì)一致。在KLF5過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，PCNA的表達(dá)活性也同步升高，提示細(xì)胞處于高增殖活性。
　　 2.3 KLF5基因敲低對(duì)VSMC cyclin D1基因表達(dá)和VSMC增殖及遷移活性的影

8、響
　　 結(jié)果顯示，導(dǎo)入KLF5-siRNA后， KLF5基因和蛋白的表達(dá)活性降低約70％以上，表明該基因已被有效敲低。
　　 3.KLF5與c-Jun相互作用介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的cyclin D1基因表達(dá)
　　 序列分析顯示，在cyclin D1基因啟動(dòng)子區(qū)存在KLF5和AP-1結(jié)合位點(diǎn)。KLF5與AP-1均可能參與cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)。本部分研究探討這兩種轉(zhuǎn)錄因子在cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄激活

9、過(guò)程中的作用及相互關(guān)系，進(jìn)一步揭示AngⅡ誘導(dǎo)cyclin D1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　 3.1 KLF5對(duì)cyclin D1啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)的影響
　　 熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，KLF5可明顯促進(jìn)cyclin D1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活活性，而缺失了N端的激活結(jié)構(gòu)域的KLF5C突變體不能激活cyclin D1啟動(dòng)子報(bào)告基因的表達(dá)。
　　 3.2 AngⅡ誘導(dǎo)cyclin D1基因表達(dá)與促進(jìn)KLF5與c-J

10、un相互作用有關(guān)
　　 ChIP分析結(jié)果顯示，用KLF5或c-Jun抗體分別沉淀AngⅡ處理細(xì)胞的染色體片段，從中均可以擴(kuò)增得到cyclin D1基因啟動(dòng)子區(qū)的2個(gè)KLF5（-868～-1094、-538～-801）和1個(gè)AP-1（-10～-245）的結(jié)合序列，但在未經(jīng)AngⅡ處理的細(xì)胞中不能檢測(cè)出上述DNA序列。表明KLF5和AP-1在反式激活cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中都發(fā)揮調(diào)控作用。
　　 3.3 KLF5與c

11、-Jun在體外相互作用
　　 GST pull-down結(jié)果顯示，細(xì)胞核蛋白中的KLF5可被GST-c-Jun融合蛋白淘選出來(lái)。而且，從AngⅡ刺激的VSMC核蛋白中，用GST-c-Jun親和得到的KLF5較對(duì)照組明顯增多。結(jié)果表明，AngⅡ可誘導(dǎo)c-Jun與KLF5在體內(nèi)、外的相互作用。
　　 3.4 AP-1與KLF5協(xié)同激活cyclin D1基因表達(dá)
　　 將cyclin D1啟動(dòng)子報(bào)告基因轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)

12、胞，AngⅡ處理可誘導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)活性；當(dāng)與c-Jun或KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，AngⅡ誘導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)活性有較大的升高；而c-Jun和KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因的激活較單獨(dú)轉(zhuǎn)染組升高1倍左右。結(jié)果表明，AP-1與KLF5在AngⅡ誘導(dǎo)的cyclin D1基因表達(dá)中具有疊加作用。
　　 4.AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 AngⅡ通過(guò)與VSMC上的相應(yīng)受體相互作用而觸發(fā)細(xì)胞增殖信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)

13、導(dǎo)，最終引起細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)及VSMC增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本部分探討了AngⅡ?qū)SMCs中MAPK信號(hào)途徑的影響，以期闡明AngⅡ誘導(dǎo)KLF5活化和促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 4.1 AngⅡ誘導(dǎo)VSMC中KLF5的磷酸化活化
　　 用磷酸化絲氨酸抗體和KLF5抗體進(jìn)行交互沉淀來(lái)檢測(cè)磷酸化KLF5的水平。當(dāng)AngⅡ作用VSMC0.5

14、 h時(shí)，磷酸化KLF5的水平開始升高，1 h時(shí)達(dá)到高峰，具有明顯的時(shí)-效關(guān)系。而在同樣條件下，KLF5總蛋白水平并無(wú)明顯改變。
　　 4.2 ERK1/2和p38MAPK通路介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的KLF5磷酸化
　　 用特異性磷酸化抗體檢測(cè)MAPK通路中的三個(gè)主要成員，即ERK1/2，JNK，p38MAPK的磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，當(dāng)AngⅡ處理VSMC15 min時(shí)，ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平開始升高，到3

15、0 min時(shí)達(dá)到高峰，并維持在此水平至2 h時(shí)開始下降。但AngⅡ處理不影響JNK的磷酸化水平。
　　 結(jié)果提示，AngⅡ可通過(guò)激活ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路而誘導(dǎo)KLF5磷酸化活化，進(jìn)而促進(jìn)cyclin D1表達(dá)和VSMC增殖。
　　 4.3 ERK1/2和p38MAPK通路介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖和cyclin D1基因表達(dá)
　　 為了證明AngⅡ激活ERK1/2/MAPK和p38/MAPK通

16、路與其促VSMC增殖作用之間的關(guān)系，用特異性阻斷劑處理細(xì)胞后，檢測(cè)了AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖活性的變化。結(jié)果顯示，加入阻斷劑PD98059和SB203580后，均可降低AngⅡ的促VSMC增殖效應(yīng)；細(xì)胞周期分析可見，AngⅡ可使G0/G1期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，S期細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞周期進(jìn)程加快；而加入阻斷劑PD98059和SB203580后，AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期變化消失。結(jié)果提示，ERK1/2和p38MAPK參與介導(dǎo)了AngⅡ促VSM

17、C增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 進(jìn)一步的報(bào)告基因分析顯示，用ERK1/2和p38MAPK通路的特異性阻斷劑阻斷AngⅡ信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，AngⅡ誘導(dǎo)的cyclin D1啟動(dòng)子-報(bào)告基因表達(dá)活性顯著降低。結(jié)果提示，ERK1/2和p38MAPK通路在AngⅡ誘導(dǎo)的cyclin D1表達(dá)中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.AngⅡ誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)VSMC增殖和遷移。
　　 2.AngⅡ促VSMC增