禽呼腸孤病毒誘導(dǎo)SPF雞的細(xì)胞自噬及其與病毒復(fù)制的關(guān)系.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是家禽的重要病原之一，其感染可引起雞和火雞的病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎等，并引起免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。本實驗室前期已證實ARV感染能夠在體外誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，且自噬有利于病毒的復(fù)制，并與ARV的致病機制有關(guān)。但是，ARV感染在體內(nèi)是否也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及影響病毒的復(fù)制，還需要進(jìn)一步驗證。
　　微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated prot

2、ein1 light chain3，LC3/Atg8）是自噬體膜上的標(biāo)記性蛋白，其表達(dá)水平在某種程度上反映了自噬的程度。本研究首先用ARVGX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞，并設(shè)立空白及陽性對照組，采集組織器官進(jìn)行LC3蛋白檢測，評價ARV感染能否誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞自噬。結(jié)果顯示，ARV感染SPF雞48h后，即在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸、法氏囊、胸腺等組織器官內(nèi)出現(xiàn)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，且心臟、盲腸、法氏囊的變化最為明顯。

3、進(jìn)一步用透射電子顯微鏡觀察ARV感染雞的心臟、盲腸和法氏囊，可發(fā)現(xiàn)變性的線粒體和典型自噬體等超微結(jié)構(gòu)的存在。上述結(jié)果說明ARV感染能夠在SPF雞體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　用ARV GX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞，分別于感染48h、72h、96h和120h后采取心臟、盲腸和法氏囊進(jìn)行LC3蛋白檢測，結(jié)果顯示，感染雞的心臟、盲腸和法氏囊中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平隨著時間的增加而增加，在72h或96h時達(dá)到高峰，96h后則

4、遞減。隨后，將采取的心臟、盲腸以及法氏囊等組織處理后感染CEF細(xì)胞，用TCID50方法進(jìn)行病毒滴度的檢測，結(jié)果顯示，心臟、盲腸和法氏囊均在72h時病毒復(fù)制水平達(dá)到高峰，96h后病毒復(fù)制水平則逐漸降低，說明ARV感染SPF雞后誘導(dǎo)的自噬與病毒復(fù)制水平之間具有一定的時間依賴性，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平和病毒復(fù)制水平均在病毒感染后72h或96h內(nèi)顯著升高。進(jìn)一步證明，ARV感染不僅能夠在雞體內(nèi)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，且能利用ARV感染觸發(fā)的短暫自噬在體內(nèi)

5、進(jìn)行病毒的復(fù)制與擴散，使得病毒復(fù)制水平在短時間內(nèi)得到提高。
　　本研究使用自噬抑制劑氯喹(CQ)對1日齡SPF雞預(yù)處理后，接種ARV GX/2010/1毒株，采集心臟、盲腸和法氏囊進(jìn)行LC3蛋白檢測及病毒滴度的測定。結(jié)果顯示，ARV感染雞心臟內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白累積明顯，而盲腸和法氏囊內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白也有所累積，表明CQ能夠抑制ARV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。進(jìn)一步將心臟、盲腸和法氏囊處理后感染CEF細(xì)胞，用TCID50方法檢測病毒滴度，結(jié)

6、果顯示，使用CQ能抑制心臟和盲腸內(nèi)ARV的復(fù)制，但在法氏囊中這種現(xiàn)象并不明顯，說明CQ能夠在抑制細(xì)胞自噬的基礎(chǔ)上抑制心臟和盲腸內(nèi)的病毒復(fù)制。
　　總之，本研究證明ARV GX/201011毒株感染1日齡SPF雞后能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但這種自噬現(xiàn)象是短期的，且自噬水平與病毒的復(fù)制具有一定的時間依賴性;ARV能夠利用機體的短期自噬使得病毒滴度得到短暫的升高;使用自噬抑制劑CQ能夠?qū)е陆M織器官細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的累積，并能使得病