自噬抑制劑減少禽呼腸孤病毒誘導的細胞及雞胚組織凋亡.pdf

1、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)感染可引起雞和火雞的病毒性關節(jié)炎、腱鞘炎和免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。己證實ARV感染能誘導細胞自噬和凋亡，且與病毒的致病作用有關，但如何降低ARV誘導的細胞凋亡有待進一步研究。本研究旨在探索自噬抑制劑CQ及E64d+pepstatinA對ARV誘導細胞凋亡的影響。
　　首先使用MTT法檢測兩種自噬抑制劑對ARV誘導的細胞生長抑制的影響。結果顯示，經兩種自噬抑制劑預處理的DF

2、1細胞感染ARV后，病毒誘導的細胞生長抑制率顯著降低。進一步經形態(tài)學觀察發(fā)現，兩種自噬抑制劑作用后，ARV誘導的DF1細胞融合病變顯著減少。最后，使用PI和Annexin V-FITC雙染法進行流式細胞術檢測，結果顯示，經CQ或E64d+pepstatinA處理后，ARV誘導的DF1細胞凋亡率顯著降低。
　　Caspase-3的裂解水平高低通常被認為是凋亡發(fā)生強弱的標志。本實驗采用westernblot法檢測ARV（GX/2010

3、/1株）感染的DF1細胞caspase-3活性，發(fā)現經CQ或E64d+pepstatinA預處理后，ARV誘導的DF1細胞凋亡率顯著降低。進一步進行病毒衣殼蛋白σC表達檢測及病毒滴度測定，發(fā)現兩種自噬抑制劑均可顯著降低病毒復制水平。
　　禽呼腸孤病毒可利用凋亡使感染禽產生病理反應，鑒于兩種自噬抑制劑可在細胞水平抑制ARV誘導的細胞凋亡，進一步進行了動物實驗。使用CQ或E64d+pepstatinA對11日齡雞胚預處理后，接種ARV

4、病毒（GX/2010/1株），并設立對照組。收集尿囊液進行病毒滴度測定，發(fā)現經兩種自噬抑制劑處理后，病毒滴度顯著低于單獨接毒組。收集組織樣品進行蛋白檢測，并統(tǒng)計雞胚死亡率，繪制生存率曲線。結果顯示，CQ或E64d+pepstatinA均可顯著抑制ARV誘導的雞胚法氏囊、心臟及腸組織細胞凋亡，進一步降低雞胚死亡率。
　　本研究證明自噬抑制劑CQ和E64d+pepstatinA在抑制自噬的基礎上可顯著抑制ARV（GX/2010/1株）