玻璃化冷凍人類卵母細胞及囊胚的安全性研究.pdf

1、至今玻璃化冷凍人類不同狀態(tài)卵母細胞及囊胚出生的嬰兒全世界已經有一千多例,但是由于對出生嬰兒缺乏終生追蹤資料及對細胞凍融過程中發(fā)生的變化缺乏全面了解,目前還有許多問題尚未解決,其臨床有效性和安全性仍是人們關注的焦點。本文就目前尚未解決的問題從以下四個方面進行了研究,從基礎到臨床系統(tǒng)評價玻璃化冷凍人類卵母細胞及囊胚的安全性,旨在為臨床應用提供有利的理論和臨床依據,目前國內外尚未見相關報道。
　　 第-部分玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細胞的

2、基礎研究
　　 目的:
　　 尋找冷凍小鼠成熟卵母細胞最低濃度的乙二醇(Ethylene glycol,EG)和最佳冷凍時機,探討其可能的機制。
　　 方法：
　　 1.不同濃度EG玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細胞。隨機分7組,分別經一步、兩步、三步法5％EG與10％EG冷凍。隨機分5組,分別經不同溫度、時間及蔗糖濃度的10％EG冷凍。隨機分4組,分別經兩步法10％EG、15％EG及20％EG冷凍。凍存1個月后

3、解凍,存活的卵母細胞孵育2h后行(Intracytoplasmic sperminjection,ICSI)受精,觀察受精、卵裂及胚胎發(fā)育情況。
　　 2.小鼠成熟卵母細胞按取卵后不同冷凍時間隨機分3組,Polscope成像系統(tǒng)觀察并測量紡錘體密度(用阻滯值Retardance值表示)、極體與紡錘體角度。入選標準:選擇冷凍-解凍后均有紡錘體的卵母細胞進行冷凍前后各值的測量及ICSI受精。
　　 結果：
　　 1.

4、不同濃度EG對小鼠成熟卵母細胞復蘇結局的影響。三組5％EG的復蘇率均為0；三組10％EG之間的存活率、囊胚率比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但是均明顯低于對照組(P<0.01,P<0.05)。五組間的存活率、受精率、卵裂率及優(yōu)質胚胎率比較,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。組1與組3的存活率均明顯低于組2和對照組(P<0.01)。
　　 2.解凍后極體與紡錘體的角度均大于冷凍前(P<0.01)；B組和C組解凍后紡錘體的Reta

5、rdance值均低于冷凍前(P<0.05),而A組則相反。B組冷凍前紡錘體的Retardance值顯著高于其它兩組(P<0.05),而A組解凍后紡錘體的Retardance值、存活率和卵裂率均明顯高于其它兩組(P<0.05,P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.兩步法15％EG及取卵后2h是玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細胞中冷凍效果最佳的濃度和時機。
　　 2.新鮮小鼠成熟卵母細胞的紡錘體變化有時間依賴性；凍融卵母

6、細胞的質量與解凍后紡錘體密度呈正相關,與極體與紡錘體角度無相關性。
　　 第二部分玻璃化冷凍人類不同狀態(tài)卵母細胞的安全陛研究
　　 目的:
　　 探討玻璃化冷凍安全性最高的人類卵母細胞及可能的機制。
　　 方法：
　　 1.按體外成熟時間分為:18h體外成熟組(A組)；24h體外成熟組(B組)；48h體外成熟組(C組)。
　　 2.按不同成熟階段分為:GV組(Germinal vesicl

7、e,GV)和MI組(MetaphaseI,MI)。
　　 3.按不同狀態(tài)分為:體內成熟組；體外成熟組；未成熟組。
　　 以上三組實驗均通過Polscope成像系統(tǒng)觀察并測量冷凍前后紡錘體密度、極體與紡錘體角度及透明帶內層厚度(Zona pellucida thickness,ZPT)和密度(Zona pellucida density,ZPD),并進行胚胎發(fā)育評估。其中第3組實驗的胚胎進一步采用熒光原位雜交法進行染色體非

8、整倍體的篩查。
　　 4.采用單細胞凝膠電泳試驗檢測不同狀態(tài)卵母細胞凍融后的DNA損傷,分為:體內成熟組,體外成熟組,未成熟組。
　　 結果：
　　 1.三組解凍后極體與紡錘體的角度、透明帶內層ZPD值均大于冷凍前,前者B組有統(tǒng)計學差異(P<0.05),后者C組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。B組與C組解凍后紡錘體的Retardance值均低于冷凍前(P<0.05)。冷凍前紡錘體的Retardance值B組顯著高于

9、其它兩組(P<0.05),而解凍后A組紡錘體的Retardance值及優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率均高于其它兩組(P<0.01,P<0.05)。
　　 2.冷凍GV組的存活率顯著高于冷凍MI組(P<0.05),而前者的體外成熟率顯著低于后者(P<0.01)；兩冷凍組解凍后透明帶內層ZPD值高于冷凍前(P<0.05)。
　　 3.兩成熟組解凍后極體與紡錘體角度、紡錘體的Retardance值均大于冷凍前,前者體內成熟組有統(tǒng)計學差

10、異(P<0.05),后者體外成熟組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；三組解凍后透明帶內層ZPD均顯著高于冷凍前(P<0.05)。未成熟組解凍后紡錘體率、紡錘體的Retardance值及卵裂率均顯著低于其它兩組(P<0.05)。三組胚胎的非整倍體率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 4.體內成熟組彗星細胞率顯著低于其它兩組(P<0.01)；未成熟組彗星細胞拖尾長度顯著高于其它兩組(P<0.05)。
　　 結論：
　　

11、 1.凍融人類不同狀態(tài)卵母細胞的質量與解凍后紡錘體密度呈正相關,與透明帶內層ZPT和ZPD、極體與紡錘體角度無相關性。建議臨床選擇解凍后紡錘體密度高的卵母細胞形成的胚胎進行移植。
　　 2.本研究證實玻璃化冷凍沒有增加凍融卵母細胞胚胎染色體的非整倍體率,但是Polscope觀察凍融人類卵母細胞紡錘體出現率及密度不能預測其胚胎非整倍體的發(fā)生,尚需產前診斷進一步評估胎兒的安全性。
　　 3.人類體外成熟卵母細胞的紡錘體變化有

12、時間依賴性。冷凍18h體外成熟卵母細優(yōu)于24h和48h體外成熟卵母細胞。冷凍MI期與GV期卵母細胞發(fā)育潛能無明顯差異。
　　 4.玻璃化冷凍人類體內成熟卵母細胞的安全性最高。其次冷凍體外成熟卵母細胞優(yōu)于未成熟卵母細胞,后者胚胎發(fā)育潛能低的因為可能與DNA損傷最大有關。但是本研究中體內成熟的卵母細胞樣本量較小,尚需加大樣本量證實。
　　 第三部分玻璃化冷凍人類成熟卵母細胞的臨床結局
　　 目的:
　　 探討

13、不同冷凍時機及解凍方法與妊娠結局的關系和臨床應用的安全性。
　　 方法：
　　 回顧性分析本中心2007.7～2009.5接受成熟卵母細胞冷凍-解凍的30例不孕癥患者的一般臨床資料,追蹤隨訪妊娠結局及胎兒出生情況。所有患者分三組:取卵后4-5h冷凍且常規(guī)法解凍(A組)；取卵后2h冷凍且常規(guī)法解凍(B組)；取卵后2h冷凍且改良法解凍(C組)。
　　 結果：
　　 1.臨床資料各值的比較,均無統(tǒng)計學差異(P>

14、0.05)。
　　 2.B組和C組的卵母細胞存活數、移植周期率均明顯高于A組(P<0.01,P<0.05)。C組的胚胎種植率、臨床妊娠率均明顯高于B組(P<0.01,P<0.05)。
　　 3.B組1例臨床妊娠2個月后胚胎停止發(fā)育。C組9例臨床妊娠(包括3例贈卵移植,5例供精移植,1例自身移植),其中1例贈卵移植在孕4個月晚期流產。8例已順利分娩五男嬰四女嬰,染色體及發(fā)育均正常,每解凍卵母細胞活產率5.9％(8/135)

15、。
　　 4.C組中用于自體、贈卵及供精移植的平均年齡、存活卵母細胞數,受精率、胚胎種植、臨床妊娠率之間比較,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.取卵后2h冷凍及改良解凍方法是提高玻璃化冷凍成熟卵母細胞臨床妊娠的關鍵,可以成功應用于臨床贈卵、供精及自體移植。
　　 2.目前本中心已經有8例妊娠順利分娩健康嬰兒,經檢索為河南省首例冷凍卵母細胞出生嬰兒,證實此項技術的安全性及有廣闊的應用

16、前景:是進行長期贈卵的一項較好方案;是睪丸取精失敗患者的有效補救措施。
　　 第四部分玻璃化冷凍人類不同階段囊胚的初步研究
　　 目的:
　　 探討玻璃化冷凍人類囊胚的最佳階段和方法。
　　 方法：
　　 選取本中心2009.9～2010.2行IVF/ICSI的患者因質量差或異常受精的廢棄胚胎,繼續(xù)培養(yǎng)至不同發(fā)育階段質量較好的囊胚。將早期囊胚和擴張期囊胚隨機分為:穿刺組、未穿刺組和對照組。解凍后囊

17、胚孵育2h、12h及16h觀察并記錄各組囊胚的復蘇、重新擴張及孵出結果。TUNEL進一步檢測囊胚細胞凋亡情況。
　　 結果：
　　 1.早期囊胚穿刺組與未穿刺組的囊胚擴張率、囊胚孵出率均明顯低于,且凋亡細胞數明顯高于對照組(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。
　　 2.擴張期囊胚穿刺組的囊胚復蘇率明顯高于未穿刺組(P<0.01),穿刺組與對照組的囊胚擴張率明顯高手,且凋亡細胞數明顯低于未穿刺組(P<0.