玻璃化冷凍保存對豬卵母細胞影響的初步研究.pdf

1、為了探索對于豬不同時期卵母細胞毒性最低,冷凍效果最佳的冷凍保護液配方,尋找最適合豬不同時期卵母細胞的冷凍方法,分析豬不同時期卵母細胞凍后發(fā)育能力降低的影響因素,從而為成功冷凍豬卵母細胞能應用于生產實際提供理論支持。因此本研究以 GV期和MII期卵母細胞作為試驗材料,應用玻璃化冷凍方法,就目前應用最多的七種冷凍保護液配方進行篩選,比較三種不同冷凍載體冷凍卵母細胞的效果差異,并通過透射電鏡方法觀察卵母細胞冷凍前后的超微結構變化,采用彗星電泳

2、方法分析冷凍對卵母細胞造成的DNA損傷情況。結果發(fā)現(xiàn):
　　1.七組冷凍保護液對 MII期卵母細胞有低毒性作用,各組分裂率、囊胚率、囊胚細胞數(shù)均低于對照組,5組的分裂率與對照組差異顯著(P<0.05),1組的囊胚率與對照組差異顯著(P<0.05)。其余各組間分裂率和囊胚率無統(tǒng)計學差異。綜合各組指標選取3組、6組和7組為對豬MII期卵母細胞的發(fā)育能力損傷最小的前三組冷凍保護液,應用GMP管對其冷凍保護效果進行比較,發(fā)現(xiàn)乙二醇單獨使用

3、或者乙二醇和二甲基亞砜混合使用都是適合MII期卵母細胞玻璃化冷凍的保護劑配方。綜合考慮,選取 HM+7.5％(DMSO+EG),HM+17%(DMSO+EG)+0.4M Su作為冷凍保護液來比較三種不同冷凍載體冷凍卵母細胞的效果差異,發(fā)現(xiàn)OPS法形態(tài)正常率顯著高于GMP法和半麥管法(P<0.05),分裂率顯著低于半麥管法(P<0.05),三種方法囊胚率差異不顯著,但半麥管法獲得5枚囊胚且囊胚細胞數(shù)量最高,OPS法獲得1枚囊胚,而GMP法

4、并未獲得囊胚。且半麥管凍融后MII期卵母細胞的分裂率高達53.67%,顯著高于 OPS法的29.33%及 GMP法的35.00%。因此半麥管法更適合MII期豬卵母細胞的玻璃化冷凍。
　　2.應用七種不同冷凍保護液處理 GV期卵母細胞發(fā)現(xiàn),各組卵母細胞極體率與對照組差異不顯著,說明冷凍保護液對 GV期卵母細胞的成熟影響較低。對成熟后卵母細胞孤雌激活發(fā)現(xiàn),1、7組的分裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)與對照組均差異顯著(P<0.05),其他各組

5、間差異不顯著。綜合各項指標選取3組、5組、6組為對GV期卵母細胞處理損傷小的前三組冷凍保護液,應用GMP法冷凍GV期卵母細胞發(fā)現(xiàn),2組獲得6枚囊胚,且第2組囊胚平均細胞數(shù)高于第1、3組。綜合考慮,選取第2組 HM+7.5%(DMSO+EG)、HM+15%(DMSO+EG)+0.5M Su作為冷凍保護液來比較三種不同冷凍載體冷凍卵母細胞的效果差異,發(fā)現(xiàn)半麥管法冷凍 GV期卵母細胞存活率顯著高于OPS法和GMP法(P<0.05),但三種方法

6、獲得的極體率、分裂率和囊胚率差異均不顯著。因此半麥管法更適合 GV期豬卵母細胞的玻璃化冷凍。
　　3.透射電鏡下觀察卵母細胞發(fā)現(xiàn),GV期卵母細胞與透明帶連接緊密,微絨毛伸入透明帶中,皮質區(qū)分布大量的線粒體。皮質區(qū)可見大量成簇的長管狀內質網,散在的高爾基體。細胞質內可見許多脂肪滴,脂滴(LD)分為兩種,一種為灰色脂滴(GLD),一種為深色脂滴(DLD),通常與線粒體相伴出現(xiàn),且脂肪滴的周圍由內質網不連續(xù)包裹著。MII期卵母細胞排出第

7、一極體,質膜下分布大量的皮質顆粒。微絨毛(Mv)縮短成矮柱狀,線粒體(Mi)常聚集存在,線粒體嵴清晰,卵周隙出現(xiàn)。細胞質包含灰色脂滴和深色脂滴兩種,無高爾基體。
　　4.凍后GV期卵母細胞透明帶、細胞膜損傷,微絨毛(Mv)消失,線粒體腫脹、嵴不明顯。皮質區(qū)以深色脂滴為主,包圍脂滴的內質網(ER)不完整,胞質內溶解為絮狀,未見高爾基體。凍后 MII期卵母細胞透明帶(ZP)損傷、微絨毛、細胞膜損傷甚至消失、極少量皮質顆粒分布于皮質區(qū)。

8、脂滴部分溶解,相互連接,脂滴周圍伴隨大量腫脹呈圓形的線粒體,
　　5.嵴不明顯。玻璃化冷凍會造成GV期、MII期卵母細胞不同程度的嚴重損傷。
　　6.采用彗星電泳方法檢測冷凍對卵母細胞DNA的損傷發(fā)現(xiàn),冷凍保護液對GV期、MII期卵母細胞的毒性較低,DNA損傷與對照組差異不顯著,但玻璃化冷凍對GV期、MII期卵母細胞的DNA損傷與對照組和冷凍保護液處理組相比差異顯著(P<0.05)。玻璃化冷凍會對不同時期卵母細胞的DNA造成