姜黃素類似物的抗氧化活性及其對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、自由基是具有非偶電子的基團(tuán)或原子，在人體內(nèi)積累到一定量時(shí)，攻擊細(xì)胞膜、酶、糖類、DNA等，引起氧化損傷相關(guān)疾病，如老年性癡呆、帕金森病、腫瘤及炎癥等。目前應(yīng)用于臨床上的抗氧化藥物的療效并不理想，急需更有效的抗氧化藥物的發(fā)現(xiàn)。姜黃素（curcumin, Cur）是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的二酮類化合物。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老消除自由基及抑制腫瘤生長(zhǎng)活性等。C

2、ur具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，藥理作用廣泛，且基本無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)水溶性差、不易被吸收、代謝快、生物利用度低等缺點(diǎn)極大地限制了它的應(yīng)用。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都對(duì)Cur的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造或修飾，多集中在苯環(huán)上取代基和β-二酮鏈上，合成一系列姜黃素衍生物或類似物。
　　基于以上背景的調(diào)研，本文在前期的研究基礎(chǔ)上，為改善Cur化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定及生物利用度差的問(wèn)題，對(duì)Cur苯環(huán)上取代基和β-二酮鏈進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)合成了一系列α,β-芐亞基環(huán)酮化合物I1

3、~30。本文將不對(duì)稱α,β-芐亞基環(huán)酮類化合物用于抗氧化作用的研究，以期得到體內(nèi)外穩(wěn)定性好、且抗氧化活性保留或更強(qiáng)的化合物?；衔颕1~25的結(jié)構(gòu)均經(jīng)過(guò)1H NMR、13C NMR和HR-MS分析確證，化合物I26~30的結(jié)構(gòu)均經(jīng)過(guò)1H NMR分析確證。
　　為了評(píng)價(jià)化合物 I1~30抗氧化能力的強(qiáng)弱，本文采用1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·）清除法來(lái)檢測(cè)其體外對(duì)自由基的清除能力，并建立 H2O2-PC12氧化損傷模型來(lái)評(píng)價(jià)

4、其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酚羥基被去除或被保護(hù)后的化合物I體外清除自由基的能力并不高，而結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)酚羥基的化合物I2（EC50=10.46μM）的清除DPPH·能力比Cur（EC50=14.24μM）強(qiáng)，酚羥基兩側(cè)被-C(CH3)3保護(hù)的I10（EC50=48.79μM）基本保持了Cur的離體清除自由基能力，I8結(jié)構(gòu)中保留了Cur一側(cè)苯環(huán)上的結(jié)構(gòu)，對(duì)清除 DPPH·的 EC50為50.58mM，也基本上保持了 Cur的離體抗氧

5、化能力。為進(jìn)一步研究化合物 I1~20對(duì)氧化損傷的細(xì)胞的保護(hù)作用，本文選用150μM的H2O2作為氧化損傷的誘導(dǎo)濃度，作用時(shí)間是3 h，建立了H2O2-PC12（AD細(xì)胞模型）氧化損傷模型。各濃度化合物I分別預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min后，再用150μM H2O2作用PC12細(xì)胞3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于H2O2單獨(dú)處理組，1.25μM、2.50μM、5.00μM、10.00μM濃度的I2提高了PC12細(xì)胞活力為5.98%、16.68%

6、、47.05%、43.68%，I6提高了25.51%、28.58%、27.99%、35.15%，對(duì)應(yīng)濃度的Cur則分別提高了22.03%、23.14%、25.13%、26.22%，說(shuō)明化合物I6對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用均比Cur強(qiáng)，I2在低濃度（1.25μM、2.50μM）時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用要低于I6和Cur，高濃度（5.00μM、10.00μM）時(shí)保護(hù)作用則強(qiáng)于I6和Cur，這可能跟 I2自身的結(jié)構(gòu)苯環(huán)上含有兩個(gè)羥

7、基很容易降解有關(guān)。另外，我們發(fā)現(xiàn)：羥基被保護(hù)后的化合物I6對(duì)離體的DPPH·清除作用和姜黃素相比并沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)，而在H2O2-PC12氧化損傷細(xì)胞模型中，I6無(wú)論是低濃度還是高濃度時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞均有較強(qiáng)的保護(hù)作用且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照Cur。
　　本文分別從離體抗氧化活性和 AD細(xì)胞模型兩個(gè)方面來(lái)共同闡明 MCH（I6）的抗氧化機(jī)制。離體抗氧化方面，本文采用了 DPPH·、超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（·OH）的清除和還原力檢測(cè)等

8、方法來(lái)綜合評(píng)價(jià)MCH的抗氧化能力。結(jié)果顯示，在480μM時(shí)MCH清除DPPH·能力為52.64%，比陽(yáng)性對(duì)照Vit C（96.14%）和Cur（83.5%）的清除能力弱，比Vit E（19.2%）的清除能力強(qiáng)。MCH對(duì)O2-·、·OH的清除均具有濃度依賴性，隨著MCH濃度的增加，清除能力增強(qiáng)。在濃度為160μM時(shí)， MCH對(duì)O2-·的清除率為62.1%，而Vit C和Cur的清除率為47.7%、43.8%；在0.125 mM時(shí)，MCH對(duì)

9、·OH清除率為48.2%，陽(yáng)性對(duì)照D-甘露醇為37.5%，進(jìn)一步說(shuō)明MCH具有很強(qiáng)的清除·OH和O2-·的能力。還原力檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)在2.50μM、5.00μM時(shí)，MCH吸光度值分別是0.196、0.256，而Vit C分別為0.102、0.242，說(shuō)明MCH在低濃度時(shí)還原能力比 Vit C強(qiáng)。以上各種自由基清除作用和還原能力檢測(cè)說(shuō)明了MCH具有一定的離體抗氧化能力。在AD細(xì)胞模型上，當(dāng)5~80μM的MCH分別作用于PC12細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞

10、不但沒(méi)有損傷反而有一定促進(jìn)生長(zhǎng)的作用；H2O2單獨(dú)作用于PC12細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降到39.7%，加入0.63~5.00μM的MCH預(yù)處理后， PC12細(xì)胞存活率上升到69.8~82.1%。這些結(jié)果說(shuō)明MCH具有明顯的PC12細(xì)胞保護(hù)作用，與光學(xué)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)數(shù)量結(jié)果相一致。MCH能明顯降低乳酸脫氫酶（LDH）漏出率及丙二醛（MDA）水平，即MCH能保護(hù)PC12細(xì)胞膜免受氧化損傷以及降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平。H2O2單獨(dú)作用于P

11、C12細(xì)胞時(shí)，與Control（100%）組相比，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平顯著升高到426.1%，而線粒體膜電位（MMP）降低到48.3%；加入0.63~5.00μM的 MCH，胞內(nèi) ROS比 H2O2單獨(dú)處理組降低了131.4~194.5%(p<0.01)，10μM的Vit E降低了184.9%(p<0.01)，MMP則明顯提高了26.5~33.7%，而10μM的Vit E提高了38.3%(p<0.01)，這也說(shuō)明MCH能顯著

12、地抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞內(nèi)的ROS含量上升，并能使 MMP逐漸上升恢復(fù)到正常水平。MCH在濃度為0.63~5.00μM時(shí)，使PC12細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且具有濃度依賴性。吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）雙染法對(duì)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量進(jìn)行觀察， AnnexinV-PI雙染法流式細(xì)胞儀定量分析發(fā)現(xiàn)，在1.25~5.00μM濃度時(shí)，MCH對(duì)H2O2引起的P

13、C12細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸減少，具有明顯的保護(hù)作用，與AO/EB染色后熒光顯微鏡下觀察到的結(jié)果相一致。檢測(cè)下游凋亡蛋白 caspase-3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) MCH能下調(diào)H2O2引起的caspase-3的過(guò)表達(dá)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文初步認(rèn)為MCH可能是通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化物質(zhì)或抗氧化酶的合成，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，降低線粒體膜電位，并下調(diào)caspase-3的表達(dá)水平來(lái)抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞氧化損傷。
　　綜上所述，本研究設(shè)計(jì)合成了30個(gè)化