PSP驅動CAPD基因的植物表達載體構建及在果樹中的遺傳轉化研究.pdf

1、我國是一個水果生產大國，栽培面積和產量均雄踞世界前列，但各種檢疫性、毀滅性的病害(如柑桔黃龍病、香蕉枯萎病和獼猴桃潰瘍病等)時刻威脅和制約著生產的發(fā)展。培育抗病品種是解決問題的根本途徑，但由于抗性資源缺乏且大部分果樹存在高度雜合、倍性復雜、育種周期長等問題，雜交育種等傳統(tǒng)的抗病育種手段難以奏效?，F(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展為果樹抗病育種提供了新的途徑，它可以獲得常規(guī)育種難以得到的新類型，從而創(chuàng)造出新種質。迄今為止，絕大部分果樹抗病基因工程育種

2、采用的啟動子是組成型的花椰菜花葉病毒35S啟動子，采用的目的基因是來源于微生物或動物、沒有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的抗性基因，安全性、專一性和表達效率存在問題。本試驗針對果樹上存在的一些韌皮部傳導的毀滅性病害(如柑桔黃龍病、香蕉枯萎病等)，首先從筍瓜中克隆了一個韌皮部特異性啟動子，并根據(jù)密碼子用法分析結果，重新設計和合成了對這些毀滅性病害有殺滅作用的柞蠶抗菌肽D基因，然后構建了多種由不同啟動子驅動標記基因或目的基因的植物表達載體，最后利用新構建的

3、植物表達載體在雙子葉木本果樹柑桔、藤本果樹獼猴桃和草本果樹草莓上進行了轉化研究。主要研究結果如下： (1)、根據(jù)已報道具韌皮部組織特異性的筍瓜韌皮部蛋白PP2序列設計引物，以山西本地種筍瓜葉片基因組DNA為模板，用PCR方法擴增得到了長度為966bp的PP2基因啟動子片段，把片段克隆入pUCm-T載體后，經(jīng)藍白斑篩選、PCR檢測和酶切鑒定后，獲得了新的重組質粒pOCm—PSP，測序和序列分析表明與兩個已報道的片段分別有95％和9

4、9％的同源性，推測具有相似的啟動子功能。 (2)、采用高頻密碼子分析法，分別對甜橙、溫州蜜柑、葡萄柚和檸檬等4種柑桔的蛋白質編碼基因序列(CDS)進行了分析，計算出了柑桔同義密碼子相對使用頻率(RFSC)，確定出了4種柑桔的高頻率密碼子，發(fā)現(xiàn)不同種類柑桔偏愛密碼子稍有差別，但不同種類柑桔的密碼子偏愛性是完全一致的。用同樣的方法，對柑桔現(xiàn)有的177個CDS進行了分析，確定出了TAA、GCT、GAT、CTI、AGG、AGA和GTT等

5、7個高頻率密碼子。將柑桔的密碼子使用頻率與人、果蠅、酵母和大腸桿菌等不同種類模式生物比較后發(fā)現(xiàn)，柑桔密碼子的偏愛性與不同種類生物有不同程度的差異；但將柑桔的密碼子使用頻率與擬南芥、番茄、水稻和尖葉蕉等不同種類的植物相比，發(fā)現(xiàn)柑桔密碼子的偏愛性與同為雙子葉植物的擬南芥、番茄完全一樣，而與水稻、尖葉蕉這兩種單子葉植物均有較大的差異。分析結果對動物或微生物的基因在柑桔中的表達或柑桔基因在微生物中的表達以及基因克隆時設計引物具有一定指導意義。

6、 (3)、根據(jù)177個GenBank中登錄的柑桔編碼蛋白密碼子用法的分析結果，優(yōu)化并重新設計和合成了含柑桔偏愛密碼子、對柑桔黃龍病等毀滅性病害有殺滅作用的柞蠶抗菌肽D基因(命名為CAPD)，克隆入pUC19克隆載體并經(jīng)測序驗證后，獲得了含新抗病基因的重組質粒pUC19-CAPD。 (4)、利用基因重組技術，分別構建了pHZ01(來源于pBI121植物表達載體和pUC<,m>-PSP重組質粒，由PSP驅動GUS報告基因)、p

7、HZ02(來源于pCAMBIA1301植物表達載體和pUCm-PSP重組質粒，由PSP驅動GUSh報告基因)、pHZ03(來源于DCAMBIA1302植物表達載體和pUCm-PSP重組質粒，由PSP驅動GFP報告基因)和pHZ04(來源于pCAMBIA1303植物表達載體和pUCm-PSP重組質粒，由PSP驅動GFP和GUSh融合報告基因)等4個由PSP驅動不同類型報告基因的新植物表達載體。利用細胞感受態(tài)法直接將4個原始的和4個新重組的

8、植物表達載體分別導入根癌農桿菌LBA4404、GV3101、EHA105和發(fā)根農桿菌Ri15834等4個農桿菌中，為利用轉基因技術來研究PSP的功能奠定了基礎。 (5)、同樣利用基因重組技術，分別構建了pHZ05(來源于pBI121植物表達載體和含密碼子優(yōu)化的抗菌肽D基因的pUC19-CAPD克隆載體，由CaMV35S組成型啟動子驅動CAPD目的基因)和pHZ06(來源于pHZ05新植物表達載體和pUCm-PSP重組質粒，由PS

9、P驅動CAPD目的基因)2個分別由組成型和韌皮部特異性啟動子驅動CAPD抗病基因的新植物表達載體。利用細胞感受態(tài)法直接將2個新重組的植物表達載體分別導入根癌農桿菌LBA4404、GV3101、EHA105和發(fā)根農桿菌Ri15834等4個農桿菌菌株中，為利用農桿菌介導的遺傳轉化技術培育果樹抗病新種質奠定了基礎。 (6)、基于轉化體系建立所需要的高效再生體系，我們首先針對暗柳橙的不同外植體進行了離體再生研究，以期得到較適合的外植體和

10、培養(yǎng)基配方。在不同梯度濃度6-BA與IBA、NAA組合的15種培養(yǎng)基上，對暗柳橙無菌實生黃化苗的上胚軸不同切段及子葉進行再生分化培養(yǎng)，確定了暗柳橙在遺傳轉化中較為合適的培養(yǎng)基配方為MT+IBA0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L。上胚軸切段較其它部位外植體更適于用作遺傳轉化的受體材料。分別以含新構建的植物表達載體pHZ05或pH06的EHA105農桿菌菌液進行了暗柳橙無菌實生黃化苗的上胚軸的轉化研究，在

11、預培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)之后，采用不同的篩選分化方式，確立了使用僅添加頭孢霉素抑制農桿菌生長的培養(yǎng)基，至外植體開始進行分化后再進行抗生素梯度濃度篩選培養(yǎng)的方式。這種篩選方式既有利于轉化芽的生長，又可減少抗生素對轉化芽的抑制作用，還可以在高濃度抗生素條件下防止非轉化芽的逃逸。篩選培養(yǎng)4個月后，得到了一批轉基因抗性芽。取其中一部分大芽葉片，提取其基因組DNA，進行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產物的測序比較，從10株轉pHZ05抗性芽中得

12、到3株轉基因植株，從60株轉pHZ06抗性芽中得到了11株轉基因植株。 (7)、以“布魯諾”實生無菌苗葉片為外植體，首先探討了葉盤放置方式和暗培養(yǎng)時間對不定芽再生的影響，建立了高效的組培再生體系；然后用根癌農桿菌介導的葉盤法，進行了不同啟動子驅動CAPD基因的轉化研究，經(jīng)預培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)和篩選處理后，獲得了若干抗性芽；最后，取其中一部分大芽葉片，提取其基因組DNA，進行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產物的測序比較，從6

13、0株轉pHZ05抗性芽中得到7株轉基因植株，從40株轉pHZ06抗性芽中得到了12株轉基因植株。 (8)、采用根癌農桿菌介導法，以草莓主栽品種“豐香”組培苗葉片為外植體，分別進行了由組成型啟動子和韌皮部特異啟動子驅動密碼子優(yōu)化抗菌肽D基因的轉化，經(jīng)預培養(yǎng)、農桿菌浸染和共培養(yǎng)后，先進行2周不加篩選抗生素的誘芽培養(yǎng)，然后經(jīng)Kan篩選，獲得了若干抗卡那霉素植株。提取部分抗性植株的基因組DNA，進行多種引物的PCR檢測和目的基因PCR產