分子佐劑對(duì)生長(zhǎng)抑素基因免疫的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、以生長(zhǎng)抑素基因(ss)與乙肝表面抗原(HBsAg，S)基因融合的真核表達(dá)質(zhì)粒pES／2SS為基礎(chǔ)，制備S/2SS與GM-CSF基因的融合表達(dá)質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒及細(xì)菌DNA等，免疫小鼠及湖羊，探討影響生長(zhǎng)抑素基因疫苗免疫應(yīng)答及促生長(zhǎng)效果的因素，了解生長(zhǎng)抑素基因免疫動(dòng)物的作用機(jī)制，建立合適的生長(zhǎng)抑素基因免疫程序，為最終獲得經(jīng)濟(jì)有效的生長(zhǎng)抑素基因免疫方法和疫苗、開發(fā)促生長(zhǎng)、提高畜牧生產(chǎn)效率的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。 1.S/2SS與GMCSF

2、基因的融合表達(dá)質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒的構(gòu)建 ①pES/2SS-GMCSF表達(dá)產(chǎn)物抗原表位預(yù)測(cè)應(yīng)用DNA軟件分析質(zhì)粒pES/2SS-GMCSF及pES/2SS融合基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和理化特性，發(fā)現(xiàn)二者s/2ss區(qū)域抗原表位一致。同樣，在插入生長(zhǎng)抑素氨基酸序列的2個(gè)區(qū)域存在抗原表位。在pES/2SS-GMCSF質(zhì)粒中，s/2ss區(qū)域以外有另外的抗原表位區(qū)，推測(cè)GMCSF不改變s/ss表達(dá)產(chǎn)物抗原表位，且能夠增強(qiáng)生長(zhǎng)抑素免疫學(xué)活性

3、。 S/2SS與GMCSF基因的融合表達(dá)質(zhì)粒和基因佐劑質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 酶切pCS/2SS-GMCSF質(zhì)粒獲得GMCSF小片段，插入到pES/2SS(有終止密碼子)和pEGS/2SS(無終止密碼子，能表達(dá)GFP蛋白)大片段中，構(gòu)建pEs/2ss-GMCSF和pEGS/2SS-GMCSF：以pEGFP-N1為質(zhì)粒載體，類似方法酶切pCGMCSF質(zhì)粒得到GMCSF小片段，合成CpG基因退火成雙鏈，構(gòu)建成pE—GMCSF和p

4、E-CpG基因佐劑質(zhì)粒；酶切、測(cè)序鑒定表明，基因的插入位點(diǎn)、方向、序列完全正確。采用脂質(zhì)體包裹法將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞使其表達(dá)，用間接ELISA或熒光顯微鏡對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，pEGS/2SS-GMCSF轉(zhuǎn)染72h后的COS細(xì)胞檢出強(qiáng)烈熒光。ELISA結(jié)果顯示，質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白均具有SS的免疫學(xué)活性，表明融合表達(dá)質(zhì)粒均可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)具有生長(zhǎng)抑素免疫學(xué)活性的融合蛋白，而表達(dá)水平pEGS/2SS

5、pEGS/2SS-GMCSF

6、行免疫。疫苗劑量為20μg/只，佐劑按等量與之混合。初次免疫2周后以相同劑量 加強(qiáng)免疫一次。 ELISA法檢測(cè)抗體水平和抗體類型， MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，CpGDNA和DNA疫苗聯(lián)合免疫后SS抗體水平、IgG2a／IgG1比值和脾淋巴細(xì)胞刺激活性(Stimulate Index，SI)值均比單一使用DNA疫苗的高(P<0.05)。免疫后4周SS抗體P／N值達(dá)峰值，以pES／2SS+CpGODN組最高。對(duì)Th

7、<,1>／Th<,2>細(xì)胞免疫應(yīng)答分型檢測(cè)，確定CpGDNA激發(fā)的抗體以IgG2a型抗體為主，RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)CpGDNA佐劑組免疫鼠只選擇性表達(dá)Th<,1>型細(xì)胞因子。這些結(jié)果表明，應(yīng)用重組生長(zhǎng)抑素真核表達(dá)質(zhì)粒免疫動(dòng)物可以產(chǎn)生SS抗體。而含CpGDNA序列的核酸佐劑產(chǎn)生了TH<,1>型免疫佐劑效應(yīng)，增強(qiáng)了生長(zhǎng)抑素基因疫苗的免疫效果。 3、CpGDNA系列佐劑對(duì)生長(zhǎng)抑素基因疫苗免疫小鼠生長(zhǎng)及GH和IGF-I的影響

8、 本試驗(yàn)同樣免疫60只小鼠，雙抗RIA法檢測(cè)GH及IGF-I水平。結(jié)果顯示，雌性小鼠免疫后4、6周，疫苗組平均增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。CpGDNA和DNA疫苗聯(lián)合免疫后的GH及IGF-I水平比單一使用DNA疫苗的高。加強(qiáng)免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以CpGDNA為佐劑的免疫組GH水平至第6周達(dá)到高峰，顯著高于pES／2SS組(P<0.01)，其中加細(xì)菌DNA組峰值最高，達(dá)6

9、.65ng／ml，加單鏈CpGDNA組GH高水平持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，至免疫后10周，仍顯著高于pES／2SS組(P<0.01)。加CpGDNA組IGF-I值顯著高于不加佐劑的pES／2SS疫苗組(P<0.01)，細(xì)菌DNA組峰值最高，達(dá)909.72ng／ml。分析第6周所檢測(cè)的各免疫組小鼠生長(zhǎng)抑素抗體P／N值、GH、IGF-I、及周增重之間的相關(guān)，GH與IGF-I水平顯著相關(guān)(P<0.05)。生長(zhǎng)抑素抗體與周增重、GH和IGF-I之間相關(guān)性未

10、達(dá)到顯著水平(P>0.05)，r值也接近1(0.696，0.709，0.856)。這些結(jié)果表明：SS基因免疫產(chǎn)生SS抗體，有效中和了內(nèi)源性SS，影響了相關(guān)激素的分泌，而含CpGDNA序列的核酸佐劑以及脂質(zhì)體粗品，可以增強(qiáng)生長(zhǎng)抑素基因疫苗的效果，并可影響GH及IGF-I的分泌水平。 4、分子佐劑對(duì)生長(zhǎng)抑素基因免疫湖羊羔羊的作用及機(jī)制研究 選擇60只斷奶湖羊母羔羊，分為6組，在用生長(zhǎng)抑素基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒pES／2

11、SS免疫的同時(shí)，分別用pE-CpG質(zhì)粒、細(xì)菌DNA、脂質(zhì)體粗品配合作為佐劑，另一組用重新構(gòu)建的pES／2SS-GMCSF免疫。免疫組每只湖羊肌肉接種4 mL含0.4 mg免疫原的稀釋液。對(duì)照組每只注射4mL生理鹽水。佐劑按等量與之混合。初次免疫4周后以相同劑量加強(qiáng)免疫一次。ELISA檢測(cè)生長(zhǎng)抑素抗體水平，雙抗RIA檢測(cè)GH及IGF-I水平。結(jié)果顯示，首次免疫4周和加強(qiáng)免疫2周后，細(xì)菌DNA佐劑組的抗體水平顯著高于生長(zhǎng)抑素單獨(dú)免疫組，其抗

12、體陽性率也為免疫各組最高，達(dá)50％。全期免疫組抗生長(zhǎng)抑素抗體陽性率達(dá)36.0％。免疫羊的增重比對(duì)照組高18.82％(P<0.01)，最優(yōu)為 pES／2SS+pE-CpG組，其次為pES／2SS+細(xì)菌DNA組，分別比對(duì)照組高33.0％和31.6％ (P<0.01)，且顯著高于pES／2SS單獨(dú)免疫組(P<0.05)。pE8／2SS-GMCSF免疫組比對(duì)照 組高21.7％(P<0.05)。加強(qiáng)免疫后2周，免疫組的GH和IGF-I

13、水平顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，抗體陽性羊的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)。分析第2、 4、6、10周所檢測(cè)的各免疫組湖羊生長(zhǎng)抑素抗體P／N值、GH、IGF-1及周增重之間的 相關(guān)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素抗體與GH、IGF-1、周增重顯著相關(guān)(P<0.01)，周增重與生長(zhǎng)抑 素抗體(P<0.01)、GH(P<0.01)、IGF-1(P<0.05)顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明：SS基因免 疫產(chǎn)生SS抗體，有效中和了

14、內(nèi)源性SS，影響了相關(guān)激素的分泌，促進(jìn)羔羊生長(zhǎng)。 5.生長(zhǎng)抑素DNA疫苗pES／2SS和pES／2SS-GMCSF免疫湖羊的安全性檢測(cè) 應(yīng)用0.4mg pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒對(duì)湖羊進(jìn)行免疫，間隔4周以 相同劑量加強(qiáng)免疫一次。采取羊全血和耳組織，提取血液和組織基因組DNA，用pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒中S基因與Kan抗性基因片段的兩對(duì)特異性引物，對(duì) pE

15、S／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒以及所采組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF質(zhì)粒中擴(kuò)增出一條660bp的s基因片段和一條840bp的Kan抗性 基因的特異性條帶，而所采組織中則沒有擴(kuò)增出特異性的條帶。因此從基因整合的角 度看，pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質(zhì)粒免疫湖羊是安全的。 綜上所述，本研究通過生長(zhǎng)抑素基因疫苗pES／2SS聯(lián)合不同佐劑免疫小鼠，發(fā)

16、現(xiàn) 含CpGDNA序列的核酸佐劑，提高了SS DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，并產(chǎn) 生了TH<,1>型免疫佐劑效應(yīng)，增強(qiáng)了生長(zhǎng)抑素基因疫苗的免疫效果，雌性小鼠免疫后 4 周、6周，疫苗組平均增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。生長(zhǎng)抑素基因免疫湖羊羔羊， 加強(qiáng)免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，抗體陽性羊 的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)，免疫羊的增重比對(duì)照組高