分子佐劑對生長抑素基因免疫的作用及其機制研究.pdf

1、以生長抑素基因(ss)與乙肝表面抗原(HBsAg，S)基因融合的真核表達質粒pES／2SS為基礎，制備S/2SS與GM-CSF基因的融合表達質粒和基因佐劑質粒及細菌DNA等，免疫小鼠及湖羊，探討影響生長抑素基因疫苗免疫應答及促生長效果的因素，了解生長抑素基因免疫動物的作用機制，建立合適的生長抑素基因免疫程序，為最終獲得經濟有效的生長抑素基因免疫方法和疫苗、開發(fā)促生長、提高畜牧生產效率的新技術奠定基礎。 1.S/2SS與GMCSF

2、基因的融合表達質粒和基因佐劑質粒的構建 ①pES/2SS-GMCSF表達產物抗原表位預測應用DNA軟件分析質粒pES/2SS-GMCSF及pES/2SS融合基因表達產物的結構和理化特性，發(fā)現二者s/2ss區(qū)域抗原表位一致。同樣，在插入生長抑素氨基酸序列的2個區(qū)域存在抗原表位。在pES/2SS-GMCSF質粒中，s/2ss區(qū)域以外有另外的抗原表位區(qū)，推測GMCSF不改變s/ss表達產物抗原表位，且能夠增強生長抑素免疫學活性

3、。 S/2SS與GMCSF基因的融合表達質粒和基因佐劑質粒的構建及鑒定 酶切pCS/2SS-GMCSF質粒獲得GMCSF小片段，插入到pES/2SS(有終止密碼子)和pEGS/2SS(無終止密碼子，能表達GFP蛋白)大片段中，構建pEs/2ss-GMCSF和pEGS/2SS-GMCSF：以pEGFP-N1為質粒載體，類似方法酶切pCGMCSF質粒得到GMCSF小片段，合成CpG基因退火成雙鏈，構建成pE—GMCSF和p

4、E-CpG基因佐劑質粒；酶切、測序鑒定表明，基因的插入位點、方向、序列完全正確。采用脂質體包裹法將重組表達質粒轉染COS細胞使其表達，用間接ELISA或熒光顯微鏡對其表達產物進行檢測。結果表明，pEGS/2SS-GMCSF轉染72h后的COS細胞檢出強烈熒光。ELISA結果顯示，質粒表達的融合蛋白均具有SS的免疫學活性，表明融合表達質粒均可在哺乳動物細胞中表達具有生長抑素免疫學活性的融合蛋白，而表達水平pEGS/2SS

5、pEGS/2SS-GMCSF

6、行免疫。疫苗劑量為20μg/只，佐劑按等量與之混合。初次免疫2周后以相同劑量 加強免疫一次。 ELISA法檢測抗體水平和抗體類型， MTT法檢測淋巴細胞增殖能力，結果顯示，CpGDNA和DNA疫苗聯合免疫后SS抗體水平、IgG2a／IgG1比值和脾淋巴細胞刺激活性(Stimulate Index，SI)值均比單一使用DNA疫苗的高(P<0.05)。免疫后4周SS抗體P／N值達峰值，以pES／2SS+CpGODN組最高。對Th

7、<,1>／Th<,2>細胞免疫應答分型檢測，確定CpGDNA激發(fā)的抗體以IgG2a型抗體為主，RT-PCR檢測進一步證實CpGDNA佐劑組免疫鼠只選擇性表達Th<,1>型細胞因子。這些結果表明，應用重組生長抑素真核表達質粒免疫動物可以產生SS抗體。而含CpGDNA序列的核酸佐劑產生了TH<,1>型免疫佐劑效應，增強了生長抑素基因疫苗的免疫效果。 3、CpGDNA系列佐劑對生長抑素基因疫苗免疫小鼠生長及GH和IGF-I的影響

8、 本試驗同樣免疫60只小鼠，雙抗RIA法檢測GH及IGF-I水平。結果顯示，雌性小鼠免疫后4、6周，疫苗組平均增重顯著高于對照組(P<0.05)。CpGDNA和DNA疫苗聯合免疫后的GH及IGF-I水平比單一使用DNA疫苗的高。加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對照組(P<0.05)。以CpGDNA為佐劑的免疫組GH水平至第6周達到高峰，顯著高于pES／2SS組(P<0.01)，其中加細菌DNA組峰值最高，達6

9、.65ng／ml，加單鏈CpGDNA組GH高水平持續(xù)時間最長，至免疫后10周，仍顯著高于pES／2SS組(P<0.01)。加CpGDNA組IGF-I值顯著高于不加佐劑的pES／2SS疫苗組(P<0.01)，細菌DNA組峰值最高，達909.72ng／ml。分析第6周所檢測的各免疫組小鼠生長抑素抗體P／N值、GH、IGF-I、及周增重之間的相關，GH與IGF-I水平顯著相關(P<0.05)。生長抑素抗體與周增重、GH和IGF-I之間相關性未

10、達到顯著水平(P>0.05)，r值也接近1(0.696，0.709，0.856)。這些結果表明：SS基因免疫產生SS抗體，有效中和了內源性SS，影響了相關激素的分泌，而含CpGDNA序列的核酸佐劑以及脂質體粗品，可以增強生長抑素基因疫苗的效果，并可影響GH及IGF-I的分泌水平。 4、分子佐劑對生長抑素基因免疫湖羊羔羊的作用及機制研究 選擇60只斷奶湖羊母羔羊，分為6組，在用生長抑素基因融合真核表達質粒pES／2

11、SS免疫的同時，分別用pE-CpG質粒、細菌DNA、脂質體粗品配合作為佐劑，另一組用重新構建的pES／2SS-GMCSF免疫。免疫組每只湖羊肌肉接種4 mL含0.4 mg免疫原的稀釋液。對照組每只注射4mL生理鹽水。佐劑按等量與之混合。初次免疫4周后以相同劑量加強免疫一次。ELISA檢測生長抑素抗體水平，雙抗RIA檢測GH及IGF-I水平。結果顯示，首次免疫4周和加強免疫2周后，細菌DNA佐劑組的抗體水平顯著高于生長抑素單獨免疫組，其抗

12、體陽性率也為免疫各組最高，達50％。全期免疫組抗生長抑素抗體陽性率達36.0％。免疫羊的增重比對照組高18.82％(P<0.01)，最優(yōu)為 pES／2SS+pE-CpG組，其次為pES／2SS+細菌DNA組，分別比對照組高33.0％和31.6％ (P<0.01)，且顯著高于pES／2SS單獨免疫組(P<0.05)。pE8／2SS-GMCSF免疫組比對照 組高21.7％(P<0.05)。加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-I

13、水平顯著高于對照組 (P<0.05)，抗體陽性羊的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)。分析第2、 4、6、10周所檢測的各免疫組湖羊生長抑素抗體P／N值、GH、IGF-1及周增重之間的 相關，發(fā)現生長抑素抗體與GH、IGF-1、周增重顯著相關(P<0.01)，周增重與生長抑 素抗體(P<0.01)、GH(P<0.01)、IGF-1(P<0.05)顯著相關。這些結果表明：SS基因免 疫產生SS抗體，有效中和了

14、內源性SS，影響了相關激素的分泌，促進羔羊生長。 5.生長抑素DNA疫苗pES／2SS和pES／2SS-GMCSF免疫湖羊的安全性檢測 應用0.4mg pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質粒對湖羊進行免疫，間隔4周以 相同劑量加強免疫一次。采取羊全血和耳組織，提取血液和組織基因組DNA，用pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF重組質粒中S基因與Kan抗性基因片段的兩對特異性引物，對 pE

15、S／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質粒以及所采組織進行PCR擴增，結果在pES／2SS 和pES／2SS-GMCSF質粒中擴增出一條660bp的s基因片段和一條840bp的Kan抗性 基因的特異性條帶，而所采組織中則沒有擴增出特異性的條帶。因此從基因整合的角 度看，pES／2SS和pES／2SS-GMCSF重組質粒免疫湖羊是安全的。 綜上所述，本研究通過生長抑素基因疫苗pES／2SS聯合不同佐劑免疫小鼠，發(fā)

16、現 含CpGDNA序列的核酸佐劑，提高了SS DNA疫苗誘導機體產生的免疫應答水平，并產 生了TH<,1>型免疫佐劑效應，增強了生長抑素基因疫苗的免疫效果，雌性小鼠免疫后 4 周、6周，疫苗組平均增重顯著高于對照組(P<0.05)。生長抑素基因免疫湖羊羔羊， 加強免疫后2周，免疫組的GH和IGF-1水平顯著高于對照組(P<0.05)，抗體陽性羊 的GH和IGF-1水平顯著高于抗體陰性羊(P<0.01)，免疫羊的增重比對照組高