RNAi沉默AQP-4技術(shù)治療膠質(zhì)瘤性腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)靶向沉默膠質(zhì)瘤內(nèi)水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP-4）的表達(dá)，觀察其對膠質(zhì)瘤源性腦水腫的治療效果。
　　 方法：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫檢索出大鼠AQP-4的mRNA基因全長，將其編碼區(qū)用基因沉默設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA，寡核苷酸序列分別為①5’-AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3’,②5’-TAG GAC CGA AGG CATGA

2、G CGA CAA C-3’，③5′-GCG GAC GCC CAG AAA GAC CTG ATCC-3′。構(gòu)建沉默AQP-4的siRNA質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，G418進(jìn)行篩選，免疫熒光化學(xué)方法檢測siRNA質(zhì)粒對AQP-4的沉默效果；建立SD大鼠顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤模型，分對照組、空載體轉(zhuǎn)染組和AQP-4 siRNA治療組；提取建模后第3、6、9、12天腦組織總RNA和總蛋白，RT-PCR和Western Blot方法檢測A

3、QP-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平；干/濕比重法和Evans藍(lán)測定法檢測大鼠不同時(shí)相腦組織含水量和血腦屏障通透性改變；比較動(dòng)物生存期。
　　 結(jié)果：細(xì)胞免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿和胞膜有低水平的AQP-4表達(dá)，轉(zhuǎn)染3個(gè)不同的siRNA后，AQP-4均有不同程度的降低，其中以①5′- AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3′核苷酸序列為siRNA的靶向沉默效果最好。后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)即以此為治療核苷酸序列。RT

4、-PCR結(jié)果顯示對照組與空載組膠質(zhì)瘤隨時(shí)間延長，腫瘤體積增大，其AQP-4表達(dá)水平亦出現(xiàn)增高趨勢，但在相同時(shí)間點(diǎn)，二組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；治療組觀測全程可見AQP-4呈極低水平表達(dá)，在相同時(shí)間點(diǎn)與前兩組比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。Western Blot結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果變化趨勢相似，治療組觀測全程可見AQP-4呈極低水平表達(dá)，在相同時(shí)間點(diǎn)與對照組和空載組比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。與對