果蠅嗅覺基因的篩選、鑒定及其功能的研究.pdf

1、果蠅嗅覺系統(tǒng)的特點及相應技術的獨特結合，使果蠅成為研究嗅覺的理想模式系統(tǒng)。本文采用SG18.1-Gal4/UAS基因篩選系統(tǒng)對改變果蠅嗅覺發(fā)育的基因進行了大規(guī)模篩選，并對分離到的Akap200進行了功能鑒定，旨在通過對果蠅嗅覺系統(tǒng)的異位表達篩選，揭示作用于嗅覺神經(jīng)的基因，為研究其功能提供大量有意義的資源。在果蠅S2細胞上對通過調(diào)節(jié)基因篩選獲得的nrg基因功能進行了研究，并對nrg和limk基因相互作用的分子機制進行了探索。主要內(nèi)容包括：

2、 1.本文首次利用SG18.1-Gal4/UAS基因篩選系統(tǒng)對果蠅嗅覺基因進行了篩選和鑒定：結果表明，所采用的方法可以快速、有效地分離到果蠅嗅覺相關基因；從1515株果蠅P{GS｝品系分離到86株突變體，其中40株有明顯表型，從中鑒定了23個基因，這些基因在ORN強迫表達時可以損壞果蠅嗅葉的固有結構：在篩選中發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)節(jié)嗅覺圖譜發(fā)育的基因可以編碼新蛋白或編碼參與軸突生長和細胞骨架重塑的蛋白；為了便于研究，根據(jù)基因的功能和所編碼

3、蛋白的特點，我們對分離到的基因進行了分類，即參與軸突引導和突觸產(chǎn)生、調(diào)節(jié)轉錄、調(diào)節(jié)細胞骨架和功能未確定或未知的基因；并通過對嗅覺感覺器的檢測發(fā)現(xiàn)，除了調(diào)節(jié)轉錄的基因外，其他基因對觸覺器的數(shù)量和分布影響不明顯。 2.首次分析了Akap200基因對果蠅嗅覺發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)超量表達Akap200可以使嗅小球發(fā)生融合，然而缺失Akap200可導致嗅小球的形態(tài)改變或出現(xiàn)異常的嗅小球，而且會影響ORN的正確定位過程。 3.構建了果蠅

4、nrg基因細胞內(nèi)片段真核表達載體：根據(jù)nrg180基因的DNA序列設計合成了一對特異性引物，擴增出了含有整個nrg180基因細胞內(nèi)片段的序列，通過序列鑒定后，應用T/A克隆和亞克隆成功地構建了S2細胞表達載體pRmHa3-nrg180-Cd，為研究nrg180基因細胞內(nèi)片段功能打下了基礎。 4.利用果蠅S2細胞對Nrg蛋白的特性進行了研究：應用陽性脂質(zhì)體轉染法，將不同的Nrg蛋白形式轉染到果蠅S2細胞并成功地獲得了表達，優(yōu)化的轉

5、染條件為DNA和脂質(zhì)體的比例為2：15(μg/μl)，轉染時間36h，0.7mMCuSO4誘導20h，在優(yōu)化的條件下最高轉染效率可以達到20％；細胞集合和定量分析試驗顯示，Nrg180和NrgGPI的表達可以快速誘導細胞集合反應而Nrg180-Cd的表達不參與細胞的吸附反應；Nrg180和NrgGPI的細胞集合在前2h內(nèi)最明顯并與對照和Nrg180-Cd的差異極顯著(P＜0.01)，進行8h時誘導細胞的集合最高可達22.2％和16.6％

6、;通過熒光染色發(fā)現(xiàn)，Nrg蛋白在S2細胞的膜上表達并誘導同源吸附反應。 5.果蠅Limk基因在S2細胞中的表達及其對nrg功能的影響：本試驗通過兩步克隆法首次構建了Limk基因的S2細胞表達質(zhì)粒pRmHa3-Limk-myc，而且該重組質(zhì)粒在S2細胞中獲得了高效表達，并發(fā)現(xiàn)Limk蛋白在S2細胞質(zhì)內(nèi)分布均勻，不影響細胞的形態(tài)，不引起S2細胞的相互吸附現(xiàn)象；細胞集合試驗證明，在S2細胞上共轉染Limk和Nrg180重組質(zhì)粒時Lim

7、k蛋白通過作用于nrg基因細胞內(nèi)片段進而影響Nrg180引起的細胞集合，主要表現(xiàn)在增強S2細胞相互吸附的強度，其次是集合細胞的數(shù)量；同時對共轉染的細胞雙重熒光染色時發(fā)現(xiàn)，Limk蛋白不在細胞質(zhì)而主要集中在細胞膜上，而且和Nrg蛋白的分布基本一致，表示Nrg蛋白對Limk蛋白的分布有重要影響。 6.雙鏈RNAi法沉默Limk基因對Nrg誘導細胞集合的影響：RNAi技術是近幾年發(fā)展起來的一種研究基因功能的的重要手段之一。本試驗首先根

8、據(jù)LimkcDNA激酶區(qū)序列設計合成了一對引物，應用RT-PCR對內(nèi)源性Limk基因是否在S2細胞表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)S2細胞中含有內(nèi)源性LimkRNA;再應用RT-PCR和熒光染色檢測dsRNAi對Limk基因表達的作用，發(fā)現(xiàn)dsRNAi可以大量地抑制S2細胞內(nèi)源性Limk基因的轉錄，也可以特異性沉默外源Limk基因在S2細胞中的表達，表明本實驗建立的雙鏈RNA干擾法是可行的；最后通過細胞集合和細胞計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，dsRNAi沉默Lim