渤海溢油區(qū)石油降解菌的篩選鑒定及功能基因研究.pdf

1、海洋約占地球表面積的四分之三，為人類提供了豐富的資源，對人類社會的存在和發(fā)展具有非常重大的意義。然而，隨著人類對海洋資源的不合理開發(fā)利用，使海洋污染日益嚴(yán)重，對人類的危害也愈發(fā)明顯。在眾多的污染源中，石油是一個不可忽視的元素。2011年渤海蓬萊19-3油田溢油事故，共造成劣四類（劣于國家海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中四類海水水質(zhì)）海水面積870平方公里，對渤海生態(tài)系統(tǒng)造成了極大危害。
　　生物修復(fù)是治理海洋石油污染的重要方法之一，其中高效石油降解

2、菌在生物修復(fù)中起著舉足輕重的作用。細(xì)菌中的石油烴降解酶類能夠催化降解石油中的烴類成為小分子物質(zhì)并以此作為生長所需的碳源和能源。烷烴羥化酶 AlkB、細(xì)胞色素P450和黃素結(jié)合蛋白AlmA是目前研究較為廣泛的石油降解酶，能夠催化烷烴降解的起始反應(yīng)。其中 AlkB和 P450主要催化短中碳鏈的烷烴，但兩者降解底物有一部分不重疊，而AlmA主要降解長鏈烷烴。
　　為獲得高效石油降解菌并對其石油烴降解酶基因進(jìn)行分析，本研究以渤海石油污染區(qū)

3、沉積物為材料篩選石油降解菌群，共分離到24株菌，包括18株細(xì)菌和6株真菌；結(jié)合實(shí)驗(yàn)室菌種庫中的石油降解相關(guān)菌株，對其石油降解率利用紫外分光光度法進(jìn)行初步測定，從18株渤海石油污染區(qū)沉積物中分離的細(xì)菌中篩選到11株高效烷烴降解菌，從實(shí)驗(yàn)室菌種庫中篩選到5株烷烴降解菌，其中菌株WSL01、WSL14、WH069和WH072的石油降解率在20％以上。將這16株具有較好石油降解能力的菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，發(fā)現(xiàn)渤海石油污染區(qū)石油降解菌主要

4、為γ-變形菌綱（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）兩大類群，且前者占90%，說明γ-變形菌綱的菌株為該區(qū)域的石油降解優(yōu)勢種群，其中高城郡海桿菌（Marinobacter goseongensis）WSL01和耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans） WH072為首次報道的高效石油降解菌，具有極大的研究和應(yīng)用價值。對高效石油降解菌的石油烴降解酶基因alkB、P450和almA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從菌

5、株WSL01、WSL14、WH069和WH072中都擴(kuò)增到了alkB、P450和almA基因，表明alkB、P450和almA基因與這些菌株的石油降解性能存在著密切關(guān)系。根據(jù)功能基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析各個石油烴降解酶基因的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p450基因在一定程度上具有種屬特異性。采用高效熱不對稱性交錯-PCR方法（hiTail-PCR），對WSL01和WH072的三種石油烴降解酶基因進(jìn)行全長序列和兩側(cè)未知序列的擴(kuò)增，獲得了