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文檔簡介
1、前言:胃癌是一種常見的上皮源性惡性腫瘤,嚴重威脅人民的身體健康,目前仍然是我國死亡率最高的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生發(fā)展是與遺傳因素、環(huán)境因素等多因素多步驟相關的過程,在這個過程中可能涉及到多個癌基因的激活與抑癌基因的失活,但其分子發(fā)病機制仍不十分清楚。分子遺傳學研究表明,多數(shù)實體腫瘤存在3號染色體短臂等位基因缺失,提示3p區(qū)域可能隱含腫瘤抑制基因。3p缺失在胃癌中也是常見事件之一。RASSF1A基因位于3p21.3,是最近確定的一種候選
2、抑癌基因,它在多人類惡性腫瘤中存在缺失;敲除RASSF1A基因可導致動物模型中胃腸道腫瘤、肺癌、乳腺癌和淋巴瘤的發(fā)生。因此RASSF1A是人類腫瘤發(fā)生中非常重要的候選抑癌基因。但目前對于RASSF1A是否抑制胃癌細胞的生長及其機制國內外尚未見報道。
目的:探討RASSF1A基因對胃癌細胞SGC7901生長的影響及其可能的作用機制。
方法:將RASSF1A基因轉染胃癌細胞株SGC7901,WesternBlotting
3、和RT-PCR篩選RASSF1A高表達克隆。MTT法繪制細胞生長曲線,流式細胞術分析細胞周期和凋亡率的變化,平板克隆形成試驗分析細胞的增殖能力,裸鼠成瘤試驗分析其致瘤性,觀察RASSF1A基因對胃癌細胞株SGC7901生長的影響。應用EMSA觀察RASSF1A對SGC7901細胞NF-κB、AP-1 DNA結合活性的影響,Western blot和免疫細胞化學技術觀察RASSF1A對SGC7901細胞c-Fos、c-Jun和P65表達的
4、影響。應用蛋白質組學技術,比較空白質粒和陽性質粒轉染細胞的蛋白表達譜,并應用RT-PCR驗證獲得的差異蛋白質點,系統(tǒng)探討RASSF1A基因抑制胃癌細胞SGC7901生長的作用機制。
結果:經(jīng)脂質體轉染和篩選,建立了高表達RASSF1A基因的SGC7901細胞系。MTT結果顯示:與未轉染組和空白質粒轉染組比較,陽性質粒轉染組SGC7901細胞生長速度明顯減慢,48 h細胞生長抑制率為28.13%。流式細胞術結果顯示:與未轉染組和
5、空白質粒轉染組相比,陽性質粒轉染組SGC7901細胞G0/G1期細胞比例明顯增加,而S期比例減少,細胞凋亡率有所增加。平板克隆形成試驗結果顯示:未轉染組、空白質粒轉染組和陽性質粒轉染組SGC7901細胞的克隆形成率分別為38.6±1.5%,39.7±2.1%和7.3±0.6%,陽性質粒轉染組克隆形成率明顯減少。裸鼠成瘤試驗結果顯示:未轉染組、空白質粒轉染組和陽性質粒轉染組SGC7901細胞成瘤潛伏期均為7天,瘤體重量分別為(1.4±0.
6、26)g、(1.5±0.32)g和(0.6±0.1)g,陽性質粒轉染組裸鼠成瘤抑制率為57.1%。在細胞未作處理時,與未轉染組和空白質粒轉染組比較,陽性質粒轉染組細胞NF-κB DNA結合活性明顯降低。長春新堿作用12h和24h后,三組細胞NF-κB DNA結合活性下降;但與未轉染組和空白質粒轉染組比較,陽性質粒轉染組SGC7901細胞NF-κB DNA結合活性下降更明顯。在阿糖胞苷作用12h后,SGC7901細胞NF-κBDNA結合活
7、性上升;但陽性質粒轉染組SGC7901細胞NF-κB DNA結合活性較未轉染組和空白質粒轉染組出現(xiàn)明顯下降。Western blot和免疫細胞化學結果顯示:與未轉染組和空白質粒轉染組比較,陽性質粒轉染組SGC7901細胞全細胞中p65表達明顯降低,細胞核中p65表達也降低。與未轉染組和空白質粒轉染組比較,陽性質粒轉染組SGC7901細胞AP-1 DNA結合活性明顯降低。Western blot和免疫細胞化學結果顯示:與未轉染組和空白質粒
8、轉染組比較,陽性質粒轉染組SGC7901細胞c-Fos表達明顯降低,但c-Jun表達未見明顯變化。蛋白質組學結果顯示:通過雙向凝膠電泳分別分離RASSF1A轉染細胞和pcDNA3.0空白質粒轉染細胞的總蛋白質,測得兩組細胞的蛋白質斑點數(shù)分別為869±23和792±53個;位置重復性分析表明陽性質粒轉染組SGC7901細胞在等電聚焦(IEF)方向上的平均偏差為0.856±0.113 mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為
9、1.021±0.129mm;空白質粒轉染SGC7901細胞在IEF方向上的平均偏差為0.847±0.125 mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.105±0.127 mm。以上結果表明我們成功地建立了分辨率較高、重復性較好的陽性質粒轉染組細胞和空白質粒轉染細胞的二維凝膠電泳圖譜。將陽性質粒轉染組細胞和空白質粒轉染細胞2D凝膠圖譜上的蛋白質點進行匹配分析,平均匹配點數(shù)為695±18個,獲得差異點35個。隨機選取12個
10、蛋白質差異點,凝膠內原位酶解后,將經(jīng)MALDI-TOF質譜分析獲得的肽質量指紋圖(PMF)搜索MS數(shù)據(jù)庫,成功鑒定8個蛋白質,包括Galectin-1、TRP-14、ACBP、PSMB5、PSMB4、TIM、Vimentin、CD79。進一步應用RT-PCR檢測了Galectin-1、TRP-14、ACBP在SGC7901細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)轉染組細胞Galectin-1、TRP-14、ACBP表達高于對照組,表明RASSF1A能上調Ga
11、lectin-1、TRP-14、ACBP的表達。
結論:1、RASSF1A過表達能抑制胃癌細胞SGC7901的生長。RASSF1A可能是胃癌抑制基因;2、抑制胃癌細胞SGC7901 NF-κB、AP-1活性可能是RASSF1A抑制胃癌細胞生長的機制之一;3、我們通過建立分辨率較高、重復性較好的空白質粒和陽性質粒轉染SGC7901細胞的二維凝膠電泳圖譜,首次發(fā)現(xiàn)RASSF1A過表達誘導了胃癌細胞SGC7901的Galectin-
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