人骨髓間充質干細胞復合生物陶瓷體外成骨能力的實驗研究.pdf

1、目的:建立體外分離、培養(yǎng)和鑒定hMSCs的方法體系：探討貝奧路生物陶瓷復合hMSCs的生物相容性及誘導成骨能力，并評價其構建組織工程骨的可行性及臨床應用價值。 方法： 1. 建立hMSCs體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法體系。 用Percoll梯度分離液離心分離單個核細胞后，置于37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)、傳代擴增。倒置顯微鏡觀察；測定其生長增殖曲線；酶聯(lián)免疫法行細胞表面抗原檢測。取生長狀態(tài)良好的第三代hMS

2、Cs，用成骨誘導液培養(yǎng)；倒置顯微鏡逐日觀察細胞形態(tài)變化；行堿性磷酸酶染色和Von—Kossa法鈣結節(jié)染色。 2. hMSCs復合貝奧路生物陶瓷體外成骨能力的實驗研究。 實驗組：細胞和生物陶瓷復合體；對照組：以相同的細胞數(shù)接種到12孔培養(yǎng)板內(nèi)。實驗組和對照組細胞在相同的條件下行成骨誘導。倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化；MTT檢測其生長增殖情況；堿性磷酸酶染色及定量檢測測定其變化情況;Von—Kossa法鈣結節(jié)染色。行

3、統(tǒng)計學分析，假定P＜0.05有統(tǒng)計學意義。 結果： 1. 密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法能有效分離提純hMSCs，體外培養(yǎng)的原代細胞在48h內(nèi)有少量細胞貼壁，隨后形成紡錐狀成纖維細胞樣集落單位，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)逐漸趨于一致；細胞生長增殖活躍；CD29和CD71表達陽性，CD34表達陰性。在誘導培養(yǎng)的第3天堿性磷酸酶染色陽性，第7天Von—Kossa法鈣結節(jié)染色陽性。 2. hMSCs能夠貼附在貝奧路生物陶

4、瓷表面及孔隙內(nèi)生長；實驗組和對照組細胞的生長曲線形態(tài)一致，在誘導培養(yǎng)早期、中期的OD值無顯著性意義(P＞0.05)，而晚期(第9天和第10天)差異有顯著性意義(P＜0.05)；實驗組和對照組細胞在誘導的第3天堿性磷酸酶染色陽性，但兩組在各時間點堿性磷酸酶定量檢測有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；兩組細胞在各時間點行Von-Kossa法鈣結節(jié)染色均有顯著差別。 結論： 1. hMSCs取材安全、方便；密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法