兔骨髓間充質干細胞體外誘導復合藻酸鈣成軟骨實驗研究.pdf

1、目的：觀察兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)，經轉化生長因子-β1(TGF-β1)等向軟骨細胞誘導8d、11d、14d、17d、20d后，與藻酸鈣凝膠復合體外培養(yǎng)，細胞在三維條件下增殖情況及共同構建組織工程化軟骨情況。
　　 方法：穿刺新西蘭大耳白兔股骨抽取骨髓，密度梯度離心法分離、培養(yǎng)BMSCs。將傳至第3代的BMSCs予以含TGF-β1、地塞米松等成份的無血清誘導液定向向軟骨細胞誘導。根據不同的誘導時間，實驗組分成為A、B、C

2、、D、E5組：A組：誘導至第8d；B組：誘導至11d；C組：誘導至14d；D組：誘導至17d；E組：誘導至20d。通過細胞形態(tài)、TB染色、Ⅱ型膠原免疫組化、培養(yǎng)液內多聚蛋白聚糖(AG)含量，比較各實驗組定向誘導成軟骨細胞情況。分別將以上各組成軟骨細胞復合藻酸鈣凝膠，以1×107/ml的密度制作為細胞-藻酸鈣凝膠珠，繼續(xù)體外培養(yǎng)14d。培養(yǎng)過程中觀察細胞在藻酸鈣凝膠中生長、增殖情況，并通過Ⅱ型膠原免疫組化、阿利新藍比色法測定各組Ⅱ型膠原表

3、達和多聚蛋白聚糖(AG)的含量，綜合比較各實驗組構建組織工程化軟骨的情況。
　　 結果：密度梯度離心法分離純化的BMSCs定向成軟骨細胞誘導8d時形態(tài)有較明顯改變，14d時具有明顯的軟骨細胞形態(tài)。誘導培養(yǎng)液在誘導4d時即可檢出少量AG，8d時AG濃度出現明顯升高，并保持緩慢升高至20d。在14d時，誘導的細胞爬片TB染色可見異染顆粒；Ⅱ型膠原免疫組化明顯陽性表現。與藻酸鈣復合后，各組成軟骨細胞在凝膠3D支架中均保持分裂增殖，AO

4、染色見細胞能增殖成“葡萄串”樣。各實驗組材料切片Ⅱ型膠原免疫組化均可見陽性表達，以C組、D組為明顯；AG含量檢測顯示各實驗組、陽性對照組間AG含量具有差異(p<0.05)，C組、D組均高于陽性對照組，以C組AG含量為最高。
　　 結論：1.采用密度梯度離心法獲取的兔BMSCs，在體外經過14d的定向誘導后基本向軟骨細胞分化；2.藻酸鈣凝膠與種子細胞生物相容性良好，可以采用注射方式植入；誘導14d后的成軟骨細胞在藻酸鈣凝膠內增殖良