中國(guó)人超重及肥胖人群中SHP基因突變的遺傳及臨床特征研究.pdf

1、肥胖被定義為身體過(guò)分增加的脂肪量以至于對(duì)身體健康產(chǎn)生有害結(jié)果的一種狀態(tài)。研究表明肥胖與2型糖尿病、代謝綜合征、某些癌癥、高血壓以及腦卒中在內(nèi)的疾患有關(guān),很清楚的是超重和肥胖的流行帶來(lái)了巨大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。依照世界衛(wèi)生組織(WHO)所制定的肥胖或超重標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)表明在西方國(guó)家,目前超過(guò)半數(shù)的成人表現(xiàn)為超重抑或肥胖。近年來(lái)在中國(guó)由于傳統(tǒng)飲食的改變、體力活動(dòng)強(qiáng)度的下降和靜態(tài)生活方式的增加導(dǎo)致超重和肥胖人數(shù)迅速增加。盡管與美國(guó)等西方國(guó)家超過(guò)半數(shù)的

2、成人超重或肥胖相比,中國(guó)的肥胖患病率相對(duì)較低,但是肥胖病的快速增長(zhǎng),特別是兒童的情況,給我們敲響了警鐘。肥胖病是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。盡管當(dāng)前飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變導(dǎo)致了全球肥胖發(fā)病率的增加,但有證據(jù)表明遺傳因素在體重的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。肥胖為一種復(fù)雜病,復(fù)雜病是由多個(gè)易感遺傳基因與環(huán)境因素共同參與且相互作用而致發(fā)病,目前闡明多基因決定因素在肥胖人群中參與發(fā)病的作用機(jī)制并非易事。然而,研究孟德爾遺傳模式的單

3、基因突變所致的肥胖為解析肥胖的發(fā)病機(jī)制提供了幫助。最近,研究發(fā)現(xiàn)幾種涉及破壞瘦素-黑皮質(zhì)素通路的單基因突變可導(dǎo)致早發(fā)性嚴(yán)重肥胖的發(fā)生,他們是:瘦素、瘦素受體、激素原轉(zhuǎn)換酶-1、阿片黑色素促皮質(zhì)素原和黑皮素4受體基因突變。這些基因編碼的蛋白質(zhì)直接或間接地調(diào)控/參與中樞黑皮素通路,從而影響著能量代謝的平衡。然而這些基因突變導(dǎo)致的肥胖多只在白種人群中發(fā)現(xiàn),且除MC4R基因突變發(fā)生率較高外,其他基因突變?cè)谌巳褐邪l(fā)生率極低,只在白人人群中個(gè)別散發(fā)

4、出現(xiàn)。Nishigori等發(fā)現(xiàn)小異二聚體伙伴基因突變?cè)谌毡救巳褐泻洼p度肥胖的發(fā)生共分離(突變發(fā)生率約為6％),證實(shí)SHP基因突變和顯性遺傳的早發(fā)性輕度肥胖相關(guān)聯(lián)。盡管缺乏SHP基因突變和日本人成人肥胖發(fā)生相關(guān)性的研究,但他們推測(cè)SHP基因突變是導(dǎo)致日本人肥胖發(fā)生的遺傳背景成分之一。但隨后對(duì)白種人的篩查發(fā)現(xiàn)功能性SHP基因突變的發(fā)生率很低。SHP基因位于1p36.1,SHP由2個(gè)外顯子及1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,其編碼257氨基酸(aa)殘基構(gòu)成的

5、蛋白質(zhì)SHP是核受體超家族的一個(gè)成員。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的配體,所以SHP是一種孤兒核受體,SHP屬于一類非典型性的核受體,其和傳統(tǒng)意義上的核受體在結(jié)構(gòu)和功能上存在相當(dāng)大的差異,其缺乏核受體所具有的保守的DNA結(jié)合區(qū)。迄今,已知涉及調(diào)節(jié)40多個(gè)不同的靶基因,這些靶基因主要涉及膽固醇/膽汁酸代謝,脂肪生成,糖異生,藥物代謝及類固醇生成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用直接測(cè)序的方法對(duì)中國(guó)人超重或肥胖人群中SHP基因突變的發(fā)生率進(jìn)行評(píng)價(jià),然后利用雙熒光素酶

6、報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)突變蛋白的功能,最后檢測(cè)突變攜帶者的臨床病理生理。評(píng)估中國(guó)人超重或肥胖人群中SHP基因突變的遺傳及臨床特征,為對(duì)SHP基因突變攜帶者進(jìn)行早期臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。本課題分為三個(gè)部分組成。
　　第一部分：中國(guó)人超重或肥胖人群中篩查SHP基因突變
　　目的:了解SHP基因突變及變異在中國(guó)人超重或肥胖人群中的發(fā)生情況以及探討SHP基因突變攜帶者表型、突變基因遺傳模式和突變的外顯性。
　　方法:應(yīng)用直接測(cè)

7、序方法對(duì)500例無(wú)親緣關(guān)系的超重抑或肥胖患者及272名非糖尿病非肥胖的健康個(gè)體進(jìn)行SHP基因啟動(dòng)子、2個(gè)外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)篩查。
　　結(jié)果:通過(guò)對(duì)500例無(wú)親緣關(guān)系超重或肥胖個(gè)體進(jìn)行SHP基因篩查,在編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)11個(gè)個(gè)體攜帶5種不同的SHP基因突變位點(diǎn),并且所有這些突變都是呈雜合狀態(tài)。其中在超重組所發(fā)現(xiàn)的突變:兩個(gè)先前國(guó)外報(bào)道過(guò)的錯(cuò)義突變G171A和G189E分別在兩個(gè)不同的個(gè)體中被發(fā)現(xiàn);一個(gè)先前報(bào)道過(guò)的無(wú)義突變R34X也在

8、該組的一個(gè)個(gè)體中被發(fā)現(xiàn);一個(gè)先前報(bào)道過(guò)的移碼突變H53fsdel10在該組的5個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的個(gè)體中被發(fā)現(xiàn);一個(gè)位于蛋白N端的新的沉默突變P10P也在該組中被發(fā)現(xiàn)。此外,我們?cè)谝粋€(gè)超重個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雜合變異IVS1+10 C→T。在肥胖組所發(fā)現(xiàn)的突變:我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的個(gè)體攜帶H53fsdel10突變(2.6%,2/77)。我們未在272例非糖尿病非肥胖健康正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)上述突變。此外,本研究在家系中觀察到SHP基因突變并不

9、完全與肥胖或超重共分離,在研究中SHP基因突變的外顯率僅為62.5%(15/24)。
　　結(jié)論:SHP基因突變可能影響中國(guó)人體重的增加及升高的血漿胰島素水平。
　　第二部分：突變型SHP基因的表達(dá)及功能檢測(cè)
　　目的:研究SHP基因突變蛋白質(zhì)與正常SHP蛋白質(zhì)在抑制功能上的差異。
　　方法:本研究通過(guò)對(duì)攜帶突變SHP基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定,然后利用SHP蛋白能和核受體HNF-4α結(jié)合形成異二聚體并抑制HNF-4

10、α的轉(zhuǎn)錄激活功能,而HNF-1α基因作為HNF-4α的靶基因, HNF-4α可以結(jié)合到HNF-1α基因上游的啟動(dòng)子部分從而對(duì)HNF-1α基因有轉(zhuǎn)錄激活功能的原理設(shè)計(jì)利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)SHP基因不同突變位點(diǎn)的功能。
　　結(jié)果:通過(guò)將攜帶SHP基因R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突變位點(diǎn)的pcDNA3.1-SHP質(zhì)粒分別和質(zhì)粒pcDNA-HNF-4α、pGL3-HNF-1α及pRL-SV40共轉(zhuǎn)

11、染MIN-m9及HepG2細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶R34X、H53fsdel10、G189E突變的SHP蛋白在不同的細(xì)胞株中其抑制功能均顯著低于野生型SHP蛋白;而G171A突變,其在HepG2細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染,檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶該突變的SHP蛋白其抑制功能和野生型SHP蛋白無(wú)顯著性差異。而在MIN-m9細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)其25ng水平時(shí)抑制功能和野生型SHP蛋白無(wú)顯著性差異,當(dāng)pcDNA3.1-SHP質(zhì)粒質(zhì)量加大5倍后,其抑制功能顯著低于野生型SHP

12、蛋白。
　　結(jié)論:R34X、H53fsdel10、G171A及G189E突變使SHP的轉(zhuǎn)錄抑制能力下降,這些突變可能與中國(guó)人超重或肥胖有關(guān)。
　　第三部分：SHP基因突變個(gè)體的臨床病理生理研究
　　目的:進(jìn)一步研究SHP基因突變攜帶者的臨床病理生理特征,了解SHP基因突變?cè)谌梭w中對(duì)糖、脂代謝及其他內(nèi)分泌激素分泌的影響,為將來(lái)對(duì)SHP基因突變攜帶者進(jìn)行臨床診治提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)測(cè)定SHP基因突變

13、攜帶者血中肥胖發(fā)生相關(guān)的激素水平以研究SHP基因突變是否伴發(fā)其他內(nèi)分泌異常;檢測(cè)血脂譜水平;以及通過(guò)對(duì)SHP基因突變攜帶者進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)和精氨酸試驗(yàn)來(lái)評(píng)估突變攜帶者的β細(xì)胞功能。
　　結(jié)果:通過(guò)對(duì)6例SHP基因H53fsdel10突變攜帶者肥胖發(fā)生相關(guān)的激素的測(cè)定發(fā)現(xiàn)SHP基因突變攜帶者肥胖相關(guān)激素水平皆在正常范圍之內(nèi),所有突變攜帶者肝腎功能正常,血脂譜水平多在正常水平。SHP基因突變攜帶者表現(xiàn)為高胰島素血癥及胰島素抵抗。

14、精氨酸試驗(yàn)時(shí),和2分鐘時(shí)SHP基因突變組胰島素分泌水平比較,正常對(duì)照組、單純性肥胖組及T2DM伴OB組的胰島素水平均顯著高于SHP基因突變組,而T2DM不伴OB組胰島素水平顯著低于SHP基因突變組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);和4分鐘時(shí)SHP基因突變組胰島素分泌水平比較,單純性肥胖組及T2DM伴OB組的胰島素水平均顯著高于SHP基因突變組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而正常對(duì)照組及T2DM不伴OB組胰島素水平與SHP基因突