尿液、尿酸對人尿道成纖維細胞TGF-β1、Smad3影響實驗研究.pdf

1、目的： 尿道損傷或尿道手術(shù)后尿道狹窄發(fā)生機率較高。至今，臨床上尚沒有切實的方法預防尿道狹窄，始終不能擺脫狹窄-擴張/手術(shù).再狹窄的怪圈，給患者帶來極大的痛苦。尿道瘢痕組織是尿道創(chuàng)傷修復過程的產(chǎn)物，沒有瘢痕組織就不會有創(chuàng)面的愈合。但是瘢痕組織一旦生長過度，就會產(chǎn)生尿道狹窄。目前研究發(fā)現(xiàn)：尿道狹窄組織存在典型的瘢痕過度增生改變。但對引起尿道瘢痕過度增生的影響因素不是很明確，因而缺乏有效的措施阻止尿道狹窄的發(fā)牛。 在對皮膚創(chuàng)面

2、瘢痕形成的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)面愈合過程中成纖維細胞表現(xiàn)出強烈的增殖能力以及膠原大量分泌、沉積，其中以I型膠原纖維為主，認為成纖維細胞過度表達及膠原的異常分泌是瘢痕產(chǎn)生的根本原因。成纖維細胞是最主要的修復細胞，在某些細胞趨化因子的作用下由創(chuàng)周向創(chuàng)面移位，合成、分泌大量的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix ECM)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transform growth factor-beta TGF-β)是目前已知的與瘢痕形成

3、關(guān)系最密切的促膠原生成因子。TGF-p的主要生物學功能是調(diào)節(jié)細胞的增殖和結(jié)締組織的合成。其中，TGF-β1在體細胞系中的TGF-β所占的比例最高(>90％)，活性最強，是成纖維細胞的強效趨化因子，可以通過旁分泌和自分泌直接或間接、單獨或協(xié)同、同時或不同時相作用于修復細胞，產(chǎn)生細胞的趨化性遷移、增生分化，細胞外基質(zhì)合成及分泌三類重要的生物學效應(yīng)。在增生性瘢痕中，TGF-β1的濃度明顯增高，且成纖維細胞對TGF-β1的敏感性也顯著增高。另外

4、，Smad3是與纖維化過程密切的一個下游信號蛋白，是介導TGF-β信號到細胞核內(nèi)的主要因子。TGF-β1、Smad3是研究增牛性瘢痕而經(jīng)常使用的重要指標，在纖維化過程中也起到了關(guān)鍵作用。 尿道狹窄的病理學改變是創(chuàng)面過度修復，產(chǎn)生增生性瘢痕，進而破壞尿道完整性，造成功能障礙。尿道作為尿液的輸出道，尿道損傷部位易受尿液的浸潤刺激。我們在臨床上注意到，尿道下裂術(shù)后尿流改道患者，尿道瘢痕狹窄的發(fā)牛率較未改道患者低許多，其機理不十分清楚。

5、關(guān)于尿液在瘢痕形成中的作用報道不多，但對尿外滲導致腹膜后纖維化病變，眾多學者較為認可。此外，有學者報導尿酸的過度沉積會引起某些沉積部位發(fā)生纖維化改變，如腎小管因尿酸鹽阻塞管腔會引起腎組織纖維化。這些提示我們，是否尿液、尿酸影響了尿道瘢痕的過度增生？在尿道創(chuàng)傷修復過程中，尿液、尿酸對尿道成纖維細胞TGF-β1、Smad3表達有何影響？本實驗研究，我們收集尿道下裂術(shù)后尿道瘢痕組織和正常尿道組織，比較尿道瘢痕和正常尿道組織TGF-pi、Sma

6、d3表達差異；同時培養(yǎng)尿道瘢痕和正常尿道中的成纖維細胞，分析兩者TGF-pi、Smad表達差異；并用模擬生理濃度的尿液和尿酸，刺激正常尿道成纖維細胞，觀察細胞TGF-β1、Smad3因子表達變化，觀察尿液和尿酸刺激對成纖維細胞I型膠原分泌的影響，討論尿液、尿酸在尿道瘢痕形成中的作用，為臨床預防和治療尿道瘢痕狹窄提供理論依據(jù)。 方法： 收集尿道下裂術(shù)后瘢痕組織及正常尿道組織的標本，通過HE染色進行兩種組織的形態(tài)學比較；采用

7、免疫組化染色比較兩者TGF-β1、Smad3蛋白表達差異。 胰酶消化法培養(yǎng)尿道瘢痕和正常尿道中的成纖維細胞。通過免疫熒光染色和RT-PCR檢測技術(shù)比較兩者TGF-β1、Smad3蛋白和TGF-β1、Smad3 mRNA的表達差異。用適當濃度的尿液和尿酸溶液刺激尿道成纖維細胞，比較刺激前后，細胞TGF-β1、Smad3蛋白及TGF-β1、Smad3 mRNA變化情況；用ELISA方法觀察尿液、尿酸刺激成纖維細胞前后I型膠原分泌變化

8、情況。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.HE染色：與正常尿道組織相比，尿道瘢痕病理學特點為管腔變窄、不規(guī)則，尿道粘膜上皮變薄，甚至消失。尿道海綿體的血管竇結(jié)構(gòu)被多數(shù)的纖維結(jié)締組織所代替，膠原纖維排列較為紊亂，可見大量肥大的成纖維細胞。 2.體外培養(yǎng)的尿道瘢痕成纖維細胞和正常尿道成纖維細胞均呈長梭形，波形蛋白(+)，角蛋白(-)，確定為實驗所需的成纖維細胞。 3.尿液、尿酸刺激對成纖維細胞的增殖有顯著促進作用。

9、 4.尿道瘢痕成纖維細胞I型膠原表達高于正常尿道成纖維細胞；尿液及尿酸刺激后，正常尿道成纖維細胞I型膠原表達明顯升高。 5.正常尿道成纖維細胞TGF-β1、Smad3蛋白表達較低，主要表達在胞漿；尿道瘢痕成纖維細胞TGF-β1、Smad3蛋白表達升高；且TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。這提示TGF-β1、Smad3是瘢痕形成的重要因子。 6.受尿液、尿酸刺激后，正常尿道成纖