樹突狀細胞影響CIK細胞體內(nèi)外特異性殺傷卵巢癌細胞的研究.pdf

1、第一部分目的:1、臍帶血CD34<'+>干細胞及單核細胞來源DC的數(shù)量、免疫表型及功能比較;2、負載卵巢癌細胞系總RNA抗原DC對CIK細胞在體外特異性殺傷的影響.方法:1、利用免疫磁珠法純化臍帶血CD34<'+>干細胞,貼壁法純化臍帶血單核細胞;2、分別在干細胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入SCF、FL、GM-CSF、IL-4及TNF-α,單核細胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入GM-CSF、IL-4及TNF-α以誘導(dǎo)成熟DC;3、計算干細胞組擴增DC的數(shù)量;4、利用

2、流式細胞儀檢測DC的免疫表型,觀察兩組來源不同DC的特異標志、表面黏附分子及HLA分子的表達有無差異,以混合淋巴細胞反應(yīng)檢測兩組來源不同DC在功能上有無差異;5、Trizol提取卵巢癌細胞系SKOV3及H08910的總RNA作為腫瘤抗原,轉(zhuǎn)染臍帶血CD34<'+>干細胞來源的DC;6、在臍帶血單個核細胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入T-INF、IL-1β、OKT-3及IL-2,誘導(dǎo)CIK細胞,計算擴增并利用流式細胞儀檢測免疫表型;7、效應(yīng)細胞分為與轉(zhuǎn)染

3、SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細胞組、與轉(zhuǎn)染H08910 DC共培養(yǎng)CIK細胞組、與未轉(zhuǎn)染DC共培養(yǎng)CIK細胞組、單純CIK細胞組;靶細胞分為SKOV3及H08910卵巢癌細胞系,分別在效靶比為100:1及50:1的條件下以LDH釋放法檢測CIK細胞的體外殺傷活性.小結(jié):1、臍帶血單個核細胞可以擴增出大量的CIK細胞,是一種高效的卵巢癌免疫治療的效應(yīng)細胞;2、臍帶血CD34<'+>干細胞在體外多種細胞因子作用下可擴增誘導(dǎo)出大量成熟有功能的

4、DC,適合作為DC的前體細胞.而以Trizol提取腫瘤細胞總RNA簡便易行,可用于沖擊DC,進而致敏CIK細胞,誘導(dǎo)出CIK細胞更強大的特異性腫瘤殺傷作用.第二部分目的:1、建立誘導(dǎo)卵巢癌患者腹水來源的DC方法,并與傳統(tǒng)外周血單核細胞來源DC做數(shù)量、免疫表型及功能的比較;2、觀察卵巢癌患者腹水來源的DC對CIK在體外及SCID小鼠體內(nèi)殺傷卵巢癌細胞系SKOV3的影響.方法:1、利用梯度密度離心法及貼壁法純化卵巢癌患者腹水及外周血中的單核

5、細胞;2、在培養(yǎng)體系內(nèi)加入GM-CSF、IL-4及TNF-α以誘導(dǎo)成熟DC;3、流式細胞儀分別檢測DC的免疫表型,觀察兩組來源不同DC的特異標志、表面黏附分子及HLA分子的表達有無差異,以混合淋巴細胞反應(yīng)比較兩組來源不同DC的功能;4、反復(fù)凍融獲得卵巢癌細胞系SKOV3全細胞抗原作為腫瘤抗原,沖擊腹水單核細胞來源的DC;5、在外周血單個核細胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入T-INF、IL-1β、OKT-3、PHA-P及IL-2,誘導(dǎo)CIK細胞,計算擴增

6、并利用流式細胞儀檢測免疫表型;6、效應(yīng)細胞分為與SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細胞組、與H08910 DC共培養(yǎng)CIK細胞組、與空白DC共培養(yǎng)CIK細胞組、單純CIK細胞組;靶細胞為SKOV3卵巢癌細胞系,分別在效靶比為50:1及25:1的條件下以LDH釋放法檢測CIK細胞的體外殺傷活性;7、SCID小鼠腹腔內(nèi)接種SKOV3細胞系1天后分別腹腔注射與SKOV3 DC共培養(yǎng)CIK細胞組、單純CIK細胞組治療及對照組,3周后處死,按評分表評定