HCMV IE86介導的乙?；{(diào)控參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展的作用機制研究.pdf

1、人巨細胞病毒(HCMV)感染和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤關系密切，病毒編碼的最主要即刻早期調(diào)控蛋白IE86與p300/CBP形成復合體，激活宿主細胞多種轉(zhuǎn)錄因子，在感染過程起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)IE86可與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB相互作用，同時我們前期研究發(fā)現(xiàn)CREB/ATF家族新成員轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)也可與p300/CBP相互結合。ATF5是一個與腫瘤、特別是膠質(zhì)瘤密切相關的轉(zhuǎn)錄因子，在膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中特異性高表達，可通過調(diào)控下游基因Eg

2、r-1，Bcl-2及Mcl-1等促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡。 本項目首先在臨床病理標本中確證HCMV感染與膠質(zhì)瘤病理分級及ATF5表達之間的關系;再通過CoIP、激光共聚焦等技術研究IE86與ATF5在細胞內(nèi)相互作用模式和共定位;在此基礎上建立IE86過表達膠質(zhì)瘤細胞荷瘤鼠模型，研究IE86蛋白對膠質(zhì)瘤細胞生物學行為和ATF5乙?；降挠绊?。項目以表觀遺傳調(diào)控乙酰化作用為切入點，研究HCMV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)漫長的感染過程中，IE

3、86是如何調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達水平變化，進而參與神經(jīng)細胞惡性行為的進程。研究從一個新的角度來探討HCMV感染在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中所扮演的角色。
　　目的:
　　1.檢測不同臨床分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標本中HCMV感染率、IE86表達與ATF5表達的相關關系。分析HCMV IE86在不同分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達的差異，以其確證HCMV感染與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的相關性。
　　2.建立體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞模型，研究HCMV

4、 IE86與ATF5的相互作用，以及該作用對宿主細胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白乙酰化水平和生物學行為的影響及其分子機制。
　　3.建立IE86過表達膠質(zhì)瘤細胞裸鼠荷瘤模型，研究IE86蛋白對腫瘤生物學行為的影響及可能的分子機制。
　　方法:
　　1.通過免疫組織化學技術，檢測不同臨床病例分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標本中HCMV IE86和ATF5的表達，統(tǒng)計分析HCMV感染及ATF5表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生及進展的相關性。
　　2.擴增

5、HCMV病毒，測定病毒滴度。體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞系U87，設立無血清培養(yǎng)組，病毒感染及IE86轉(zhuǎn)染組，qRT PCR、western-blot檢測IE、ATF5等基因的表達變化;MTT檢測細胞增殖;流式細胞術檢測凋亡率改變。觀察病毒感染及IE86轉(zhuǎn)染在培養(yǎng)基血清撤離環(huán)境下，對膠質(zhì)瘤細胞的影響。同時設立ATF5 RNAi表達抑制組，研究ATF5參與病毒感染及IE過表達引起腫瘤增殖凋亡改變中的分子機制。
　　3.利用激光共聚焦技術觀察體

6、外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細胞中IE86與ATF5的亞細胞水平共定位;利用免疫共沉淀技術研究IE86蛋白與ATF5的相互作用，同時利用Western blot、免疫共沉淀技術分析IE86過表達對ATF5表達及乙酰化水平的影響。探討HCMV IE86蛋白調(diào)控腫瘤細胞生長的分子機制。
　　4.將IE86過表達的膠質(zhì)瘤細胞U87注射入裸鼠腋下，同時設立ATF5表達缺失組及對照組。觀察注射部位直至成瘤，記錄裸鼠出瘤的時間、腫瘤的大小，觀察移植瘤

7、的組織結構特點，計算活體移植瘤的體積。終止實驗時，取一部分移植瘤Western-blot技術檢測ATF5表達變化及乙酰化水平。
　　結果:
　　1.53例腦星形膠質(zhì)細胞瘤和5例非腫瘤組織免疫組織化學染色結果提示，HCMVIE和ATF5在間變性膠質(zhì)瘤(anaplastic gliomas，AG)、膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GM)和低級星形細胞瘤(low-grade gliomas，LGG)中

8、的表達水平明顯高于非腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義;HCMV IE陽性率與ATF5表達成明顯正相關關系（r-0.810，P＜0.01）。
　　2.ATF5在膠質(zhì)瘤細胞系U87中高表達，培養(yǎng)液血清缺失，會抑制U87細胞的增殖，引起鏡下可見的細胞皺縮凋亡。CCK-8檢測結果顯示，HCMV感染和IE86過表達可促進細胞的增殖;流式細胞術凋亡檢測顯示，IE86過表達可幫助細胞抵抗血清缺失引起的細胞凋亡。而對于ATF5表達抑制組，HCMV感染及

9、IE86過表達則不會使U87細胞抵抗血清缺失引起的細胞凋亡。
　　3.qRT-PCR及Western blot檢測結果顯示，培養(yǎng)液血清缺失會下調(diào)ATF5的表達，而HCMV感染及IE86過表達，會促進ATF5及其下游基因的表達。
　　4.免疫熒光結果顯示，IE86蛋白和ATF5在U87膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)共定位于細胞核;免疫共沉淀結果顯示IE86與內(nèi)源性ATF5存在相互作用;通過ATF5蛋白氨基端缺失負顯性抑制載體研究發(fā)現(xiàn)，IE86與

10、ATF5的結合依賴于其氨基端脯氨酸富集的區(qū)域。
　　5.免疫共沉淀及western blot結果顯示，血清饑餓48h后，ATF5的乙?；较陆?，與乙?；竝300的結合減弱;IE86過表達會加強ATF5與p300的結合，提高ATF5的乙?；剑瑥亩龠M細胞增殖。
　　6.體內(nèi)實驗結果顯示，成功構建出膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤動物模型。正常U87細胞中，HCMV IE86過表達組裸鼠的腫瘤體積增長速度、腫瘤終體積及重量均明顯高于

11、其他對照組(p＜0.05)。western blot方法檢測情況顯示，IE86過表達組的ATF5表達水平及乙?；骄黠@高于對照組(P＜0.05)。在ATF5表達抑制U87中，HCMV IE86過表達不會加速腫瘤生長，增加腫瘤的終體積。
　　結論:
　　1.HCMV IE86及ATF5在膠質(zhì)瘤中高表達，表達具有相關性，且與膠質(zhì)瘤病理分級程度正相關。
　　2.HCMV感染及IE86過表達能在體外增強膠質(zhì)瘤細胞系U87的