組蛋白去乙?;?、6在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、惡性神經膠質瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤,復發(fā)率高,死亡率高,預后較差。HDACs是一個非常龐大的家族,在真核細胞生物內,HDACs被分成4大類,共包括18種同工酶。其中,組蛋白去乙?;?(histone deacetylases-1,HDAC1)可能是這些同工酶中最重要的之一,與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯系。
  本研究中,我們首先檢測了正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中HDAC1、HDAC6的表達水平,結果表明

2、HDAC1、HDAC6在膠質瘤組織中較正常腦組織中表達增高,可望將HDAC1、HDAC6作為抗膠質瘤治療的潛在靶點;接下來,我們分別研究了基因敲除或過表達HDAC1后惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力的變化以及使用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6后惡性膠質瘤細胞增殖能力的變化;最后,我們探討了PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路在HDAC1調控惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲過程中的作用機制,以及TGF-β/SMAD信號通路

3、在HDAC6調控惡性膠質瘤細胞的增殖過程中的作用機制。
  第一部分 組蛋白去乙?;?在惡性膠質瘤細胞增殖、侵襲中的作用及其機制
  第一章 HDAC1在正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中的蛋白及mRNA表達情況
  目的:探討HDAC1在正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中的蛋白及mRNA表達情況。
  方法:收集南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、暨南大學附屬第一醫(yī)院、中山大學附屬腫瘤醫(yī)院71例手術切除的腦膠質瘤病理組

4、織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內減壓時切除的相對正常腦組織。采用免疫組化及RT-qPCR檢測組織標本中HDAC1的蛋白及mRNA表達水平。采用t檢驗、單因素方差分析及卡方檢驗進行統(tǒng)計分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:膠質瘤組織中HDAC1的蛋白表達水平高于正常腦組織(P=0.03);膠質瘤組織中HDAC1的mRNA表達水平高于正常腦組織(P=0.000),不同病理級別之間HDAC1的mRNA表達水平無差異(P=

5、0.837),表明HDAC1 mRNA表達與腦膠質瘤的病理級別無相關性。
  結論:HDAC1的蛋白及mRNA表達水平在膠質瘤組織中較正常腦組織中增高,提示HDAC1可能在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
  第二章 HDAC1影響惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲過程
  目的:探討基因敲除及過表達HDAC1能否對U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力產生影響。
  方法:以膠質瘤細胞系U87MG為研究對象,分別采用

6、小分子RNA(siRNA)干擾技術敲除HDAC1及質粒轉染過表達HDAC1;利用Western Blot檢測U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達情況;MTS增殖實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力,Transwell侵襲實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的侵襲能力。采用t檢驗、單因素方差分析進行統(tǒng)計分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:siRNA干擾技術敲除HDAC1后,各實驗組U87

7、MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達水平明顯下降,提示轉染成功,各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力下降(P<0.05);質粒轉染過表達HDAC1后,各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達增加,提示轉染成功,各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞增殖、侵襲能力增強(P<0.05)。
  結論:HDAC1可對惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力產生影響,進一步證實了HDAC1在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,

8、有望將其作為抗膠質瘤治療的潛在靶點。
  第三章 HDAC1通過調控PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路影響惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲過程。
  目的:探索PI3K/AKT及MEK/ERK信號傳導通路在HDAC1調控膠質瘤細胞增殖、侵襲過程中的作用及機制。
  方法:以膠質瘤細胞系U87MG為研究對象,分別采用siRNA干擾技術敲除HDAC1及質粒轉染過表達HDAC1,同時予以PI3K及MEK特異性抑制劑抑制相關信

9、號通路。實驗分組如下:siRNA干擾基因敲除HDAC1實驗分為3組:正常組、干擾對照組、siRNA干擾HDAC1基因敲除組;質粒轉染過表達HDAC1實驗分為6組:正常組、過表達對照組、HDAC1過表達組、HDAC1過表達+PI3K抑制組、HDAC1過表達+MEK抑制組、HDAC1過表達+PI3K抑制+MEK抑制組。利用Western Blot檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表

10、達情況;MTS增殖實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力,Transwell侵襲實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的侵襲能力。采用t檢驗、單因素方差分析進行統(tǒng)計分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:siRNA干擾技術敲除HDAC1后,干擾組U87MG惡性膠質瘤細胞HDAC1蛋白的表達水平明顯下降,提示轉染成功,干擾組U87MG惡性膠質瘤細胞中AKT、ERK總蛋白水平無變化,p-AKT、p-ERK蛋

11、白水平下降,U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力下降;質粒轉染過表達HDAC1后,各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達增加,提示轉染成功,各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中AKT、ERK總蛋白水平無變化,HDAC1過表達組p-AKT、p-ERK蛋白水平升高,U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較正常組增強,HDAC1過表達+PI3K抑制組p-AKT蛋白水平下降、p-ERK蛋白水平無變化,U87MG惡性膠質瘤細胞

12、的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組下降,HDAC1過表達+MEK抑制組p-ERK蛋白水平下降,p-AKT蛋白水平無變化,U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組下降,HDAC1過表達+PI3K抑制+MEK抑制組p-AKT、p-ERK蛋白水平下降,U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組明顯下降(P<0.05)。
  結論:HDAC1可能通過異常激活PI3K/AKT和MEK/ERK信號傳導通

13、路來調控惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲過程,本研究有望為惡性膠質瘤的治療找尋到新的靶點及突破口。
  第二部分 組蛋白去乙?;?在惡性膠質瘤細胞增殖中的作用及其機制
  第一章 HDAC6在正常腦組織及惡性膠質瘤組織中的mRNA表達情況
  目的:探討HDAC6在正常腦組織及惡性膠質瘤組織中mRNA表達差異。
  方法:收集南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、暨南大學附屬第一醫(yī)院、中山大學附屬腫瘤醫(yī)院12例手術切除的腦膠質瘤病理

14、組織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內減壓時切除的相對正常腦組織,采用qPCR檢測組織標本中HDAC1的mRNA表達水平。采用t檢驗進行統(tǒng)計分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:膠質瘤組織中HDAC6的mRNA表達水平高于正常腦組織(P<0.05),表明HDAC6 mRNA水平在腦膠質瘤組織中存在高表達。
  結論:HDAC6在膠質瘤組織中較正常腦組織中表達增高,提示HDAC6同樣可能在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著

15、重要作用。
  第二章 HDAC6通過調控TGF-β/SMAD信號通路對惡性膠質瘤細胞的增殖過程產生影響
  目的:探索TGF-β/SMAD信號傳導通路在HDAC6調控膠質瘤細胞增殖過程中的作用及機制。
  方法:以惡性膠質瘤細胞系A-172、U87MG為研究對象,分別利用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6及SMAD2磷酸化的誘導劑(重組人TGFβ1)加入各實驗組中,實驗分組如下:陰性對照組(無任何干預

16、)、ACY-1215組(A-172、U87MG膠質瘤細胞中分別加入HDAC6抑制劑ACY-1215)、重組人TGFβ1組(A-172、U87MG膠質瘤細胞中分別加入重組人TGFβ1);利用Western Blot檢測各實驗組A-172、U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC6、SMAD2、p-SMAD2、p21蛋白的表達情況;MTT增殖實驗檢測各實驗組A-172、U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力,探討HDAC6能否通過激活TGF-β/SM

17、AD相關的信號通路來調控膠質瘤細胞的增殖能力。利用軟件SPSS16.0對實驗數據進行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析;P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:實驗組加入HDAC6抑制劑ACY-1215后,Western blot實驗結果表明實驗組A-172、U87MG膠質瘤細胞中HDAC6蛋白的表達水平明顯下降,抑制劑ACY-1215能顯著提高SMAD2的磷酸化,以及提高后續(xù)的一種眾所周知的細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑

18、p21的表達量,重組人TGFβ1顯著誘導SMAD2的磷酸化并能顯著提高p21的含量,但并不影響HDAC6蛋白水平;同時,MTT增殖實驗結果表明抑制HDAC6后能顯著降低的膠質瘤細胞的增殖能力(P<0.05),重組人TGFβ1的干預作用可抑制惡性膠質瘤細胞的增殖能力(P<0.05)。
  結論:惡性膠質瘤細胞的增殖能力可被HDAC6抑制劑(ACY-1215)顯著抑制,HDAC6可通過抑制TGFβ/SMAD信號傳導通路來促進惡性膠質瘤

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