組蛋白去乙?；?、6在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，復(fù)發(fā)率高，死亡率高，預(yù)后較差。HDACs是一個(gè)非常龐大的家族，在真核細(xì)胞生物內(nèi)，HDACs被分成4大類，共包括18種同工酶。其中，組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases-1，HDAC1)可能是這些同工酶中最重要的之一，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。
　　本研究中，我們首先檢測(cè)了正常腦組織及不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中HDAC1、HDAC6的表達(dá)水平，結(jié)果表明

2、HDAC1、HDAC6在膠質(zhì)瘤組織中較正常腦組織中表達(dá)增高，可望將HDAC1、HDAC6作為抗膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn);接下來(lái)，我們分別研究了基因敲除或過(guò)表達(dá)HDAC1后惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力的變化以及使用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6后惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的變化;最后，我們探討了PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)通路在HDAC1調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲過(guò)程中的作用機(jī)制，以及TGF-β/SMAD信號(hào)通路

3、在HDAC6調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　第一部分 組蛋白去乙酰化酶1在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲中的作用及其機(jī)制
　　第一章 HDAC1在正常腦組織及不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的蛋白及mRNA表達(dá)情況
　　目的:探討HDAC1在正常腦組織及不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的蛋白及mRNA表達(dá)情況。
　　方法:收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院、暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院71例手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤病理組

4、織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內(nèi)減壓時(shí)切除的相對(duì)正常腦組織。采用免疫組化及RT-qPCR檢測(cè)組織標(biāo)本中HDAC1的蛋白及mRNA表達(dá)水平。采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析及卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:膠質(zhì)瘤組織中HDAC1的蛋白表達(dá)水平高于正常腦組織(P=0.03);膠質(zhì)瘤組織中HDAC1的mRNA表達(dá)水平高于正常腦組織(P=0.000)，不同病理級(jí)別之間HDAC1的mRNA表達(dá)水平無(wú)差異(P=

5、0.837)，表明HDAC1 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論:HDAC1的蛋白及mRNA表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組織中較正常腦組織中增高，提示HDAC1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二章 HDAC1影響惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲過(guò)程
　　目的:探討基因敲除及過(guò)表達(dá)HDAC1能否對(duì)U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力產(chǎn)生影響。
　　方法:以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG為研究對(duì)象，分別采用

6、小分子RNA(siRNA)干擾技術(shù)敲除HDAC1及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HDAC1;利用Western Blot檢測(cè)U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)情況;MTS增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:siRNA干擾技術(shù)敲除HDAC1后，各實(shí)驗(yàn)組U87

7、MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，提示轉(zhuǎn)染成功，各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力下降(P＜0.05);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HDAC1后，各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)增加，提示轉(zhuǎn)染成功，各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:HDAC1可對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力產(chǎn)生影響，進(jìn)一步證實(shí)了HDAC1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，

8、有望將其作為抗膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。
　　第三章 HDAC1通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)通路影響惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲過(guò)程。
　　目的:探索PI3K/AKT及MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在HDAC1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程中的作用及機(jī)制。
　　方法:以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG為研究對(duì)象，分別采用siRNA干擾技術(shù)敲除HDAC1及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HDAC1，同時(shí)予以PI3K及MEK特異性抑制劑抑制相關(guān)信

9、號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)分組如下:siRNA干擾基因敲除HDAC1實(shí)驗(yàn)分為3組:正常組、干擾對(duì)照組、siRNA干擾HDAC1基因敲除組;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HDAC1實(shí)驗(yàn)分為6組:正常組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組、HDAC1過(guò)表達(dá)組、HDAC1過(guò)表達(dá)+PI3K抑制組、HDAC1過(guò)表達(dá)+MEK抑制組、HDAC1過(guò)表達(dá)+PI3K抑制+MEK抑制組。利用Western Blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表

10、達(dá)情況;MTS增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:siRNA干擾技術(shù)敲除HDAC1后，干擾組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞HDAC1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，提示轉(zhuǎn)染成功，干擾組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AKT、ERK總蛋白水平無(wú)變化，p-AKT、p-ERK蛋

11、白水平下降，U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力下降;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HDAC1后，各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC1蛋白的表達(dá)增加，提示轉(zhuǎn)染成功，各實(shí)驗(yàn)組U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AKT、ERK總蛋白水平無(wú)變化，HDAC1過(guò)表達(dá)組p-AKT、p-ERK蛋白水平升高，U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力較正常組增強(qiáng)，HDAC1過(guò)表達(dá)+PI3K抑制組p-AKT蛋白水平下降、p-ERK蛋白水平無(wú)變化，U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞

12、的增殖、侵襲能力較HDAC1過(guò)表達(dá)組下降，HDAC1過(guò)表達(dá)+MEK抑制組p-ERK蛋白水平下降，p-AKT蛋白水平無(wú)變化，U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過(guò)表達(dá)組下降，HDAC1過(guò)表達(dá)+PI3K抑制+MEK抑制組p-AKT、p-ERK蛋白水平下降，U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過(guò)表達(dá)組明顯下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:HDAC1可能通過(guò)異常激活PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通

13、路來(lái)調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲過(guò)程，本研究有望為惡性膠質(zhì)瘤的治療找尋到新的靶點(diǎn)及突破口。
　　第二部分 組蛋白去乙?；?在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制
　　第一章 HDAC6在正常腦組織及惡性膠質(zhì)瘤組織中的mRNA表達(dá)情況
　　目的:探討HDAC6在正常腦組織及惡性膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達(dá)差異。
　　方法:收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院、暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院12例手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤病理

14、組織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內(nèi)減壓時(shí)切除的相對(duì)正常腦組織，采用qPCR檢測(cè)組織標(biāo)本中HDAC1的mRNA表達(dá)水平。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:膠質(zhì)瘤組織中HDAC6的mRNA表達(dá)水平高于正常腦組織(P＜0.05)，表明HDAC6 mRNA水平在腦膠質(zhì)瘤組織中存在高表達(dá)。
　　結(jié)論:HDAC6在膠質(zhì)瘤組織中較正常腦組織中表達(dá)增高，提示HDAC6同樣可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著

15、重要作用。
　　第二章 HDAC6通過(guò)調(diào)控TGF-β/SMAD信號(hào)通路對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程產(chǎn)生影響
　　目的:探索TGF-β/SMAD信號(hào)傳導(dǎo)通路在HDAC6調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及機(jī)制。
　　方法:以惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)-172、U87MG為研究對(duì)象，分別利用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6及SMAD2磷酸化的誘導(dǎo)劑（重組人TGFβ1）加入各實(shí)驗(yàn)組中，實(shí)驗(yàn)分組如下:陰性對(duì)照組（無(wú)任何干預(yù)

16、）、ACY-1215組（A-172、U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分別加入HDAC6抑制劑ACY-1215）、重組人TGFβ1組（A-172、U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分別加入重組人TGFβ1）;利用Western Blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組A-172、U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC6、SMAD2、p-SMAD2、p21蛋白的表達(dá)情況;MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組A-172、U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，探討HDAC6能否通過(guò)激活TGF-β/SM

17、AD相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。利用軟件SPSS16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析;P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組加入HDAC6抑制劑ACY-1215后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組A-172、U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC6蛋白的表達(dá)水平明顯下降，抑制劑ACY-1215能顯著提高SMAD2的磷酸化，以及提高后續(xù)的一種眾所周知的細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑

18、p21的表達(dá)量，重組人TGFβ1顯著誘導(dǎo)SMAD2的磷酸化并能顯著提高p21的含量，但并不影響HDAC6蛋白水平;同時(shí)，MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制HDAC6后能顯著降低的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)，重組人TGFβ1的干預(yù)作用可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)。
　　結(jié)論:惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力可被HDAC6抑制劑(ACY-1215)顯著抑制，HDAC6可通過(guò)抑制TGFβ/SMAD信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤