組蛋白去乙?；?、6在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、惡性神經膠質瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤，復發(fā)率高，死亡率高，預后較差。HDACs是一個非常龐大的家族，在真核細胞生物內，HDACs被分成4大類，共包括18種同工酶。其中，組蛋白去乙?；?(histone deacetylases-1，HDAC1)可能是這些同工酶中最重要的之一，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯系。
　　本研究中，我們首先檢測了正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中HDAC1、HDAC6的表達水平，結果表明

2、HDAC1、HDAC6在膠質瘤組織中較正常腦組織中表達增高，可望將HDAC1、HDAC6作為抗膠質瘤治療的潛在靶點;接下來，我們分別研究了基因敲除或過表達HDAC1后惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力的變化以及使用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6后惡性膠質瘤細胞增殖能力的變化;最后，我們探討了PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路在HDAC1調控惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲過程中的作用機制，以及TGF-β/SMAD信號通路

3、在HDAC6調控惡性膠質瘤細胞的增殖過程中的作用機制。
　　第一部分 組蛋白去乙?；?在惡性膠質瘤細胞增殖、侵襲中的作用及其機制
　　第一章 HDAC1在正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中的蛋白及mRNA表達情況
　　目的:探討HDAC1在正常腦組織及不同病理級別膠質瘤組織中的蛋白及mRNA表達情況。
　　方法:收集南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、暨南大學附屬第一醫(yī)院、中山大學附屬腫瘤醫(yī)院71例手術切除的腦膠質瘤病理組

4、織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內減壓時切除的相對正常腦組織。采用免疫組化及RT-qPCR檢測組織標本中HDAC1的蛋白及mRNA表達水平。采用t檢驗、單因素方差分析及卡方檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:膠質瘤組織中HDAC1的蛋白表達水平高于正常腦組織(P=0.03);膠質瘤組織中HDAC1的mRNA表達水平高于正常腦組織(P=0.000)，不同病理級別之間HDAC1的mRNA表達水平無差異(P=

5、0.837)，表明HDAC1 mRNA表達與腦膠質瘤的病理級別無相關性。
　　結論:HDAC1的蛋白及mRNA表達水平在膠質瘤組織中較正常腦組織中增高，提示HDAC1可能在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二章 HDAC1影響惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲過程
　　目的:探討基因敲除及過表達HDAC1能否對U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力產生影響。
　　方法:以膠質瘤細胞系U87MG為研究對象，分別采用

6、小分子RNA(siRNA)干擾技術敲除HDAC1及質粒轉染過表達HDAC1;利用Western Blot檢測U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達情況;MTS增殖實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力，Transwell侵襲實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的侵襲能力。采用t檢驗、單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:siRNA干擾技術敲除HDAC1后，各實驗組U87

7、MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達水平明顯下降，提示轉染成功，各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力下降(P＜0.05);質粒轉染過表達HDAC1后，各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達增加，提示轉染成功，各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞增殖、侵襲能力增強(P＜0.05)。
　　結論:HDAC1可對惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力產生影響，進一步證實了HDAC1在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，

8、有望將其作為抗膠質瘤治療的潛在靶點。
　　第三章 HDAC1通過調控PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路影響惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲過程。
　　目的:探索PI3K/AKT及MEK/ERK信號傳導通路在HDAC1調控膠質瘤細胞增殖、侵襲過程中的作用及機制。
　　方法:以膠質瘤細胞系U87MG為研究對象，分別采用siRNA干擾技術敲除HDAC1及質粒轉染過表達HDAC1，同時予以PI3K及MEK特異性抑制劑抑制相關信

9、號通路。實驗分組如下:siRNA干擾基因敲除HDAC1實驗分為3組:正常組、干擾對照組、siRNA干擾HDAC1基因敲除組;質粒轉染過表達HDAC1實驗分為6組:正常組、過表達對照組、HDAC1過表達組、HDAC1過表達+PI3K抑制組、HDAC1過表達+MEK抑制組、HDAC1過表達+PI3K抑制+MEK抑制組。利用Western Blot檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表

10、達情況;MTS增殖實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力，Transwell侵襲實驗檢測各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞的侵襲能力。采用t檢驗、單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:siRNA干擾技術敲除HDAC1后，干擾組U87MG惡性膠質瘤細胞HDAC1蛋白的表達水平明顯下降，提示轉染成功，干擾組U87MG惡性膠質瘤細胞中AKT、ERK總蛋白水平無變化，p-AKT、p-ERK蛋

11、白水平下降，U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力下降;質粒轉染過表達HDAC1后，各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC1蛋白的表達增加，提示轉染成功，各實驗組U87MG惡性膠質瘤細胞中AKT、ERK總蛋白水平無變化，HDAC1過表達組p-AKT、p-ERK蛋白水平升高，U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較正常組增強，HDAC1過表達+PI3K抑制組p-AKT蛋白水平下降、p-ERK蛋白水平無變化，U87MG惡性膠質瘤細胞

12、的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組下降，HDAC1過表達+MEK抑制組p-ERK蛋白水平下降，p-AKT蛋白水平無變化，U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組下降，HDAC1過表達+PI3K抑制+MEK抑制組p-AKT、p-ERK蛋白水平下降，U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖、侵襲能力較HDAC1過表達組明顯下降(P＜0.05)。
　　結論:HDAC1可能通過異常激活PI3K/AKT和MEK/ERK信號傳導通

13、路來調控惡性膠質瘤細胞的增殖及侵襲過程，本研究有望為惡性膠質瘤的治療找尋到新的靶點及突破口。
　　第二部分 組蛋白去乙?；?在惡性膠質瘤細胞增殖中的作用及其機制
　　第一章 HDAC6在正常腦組織及惡性膠質瘤組織中的mRNA表達情況
　　目的:探討HDAC6在正常腦組織及惡性膠質瘤組織中mRNA表達差異。
　　方法:收集南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、暨南大學附屬第一醫(yī)院、中山大學附屬腫瘤醫(yī)院12例手術切除的腦膠質瘤病理

14、組織及12例癲癇顳葉切除及腦外傷內減壓時切除的相對正常腦組織，采用qPCR檢測組織標本中HDAC1的mRNA表達水平。采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:膠質瘤組織中HDAC6的mRNA表達水平高于正常腦組織(P＜0.05)，表明HDAC6 mRNA水平在腦膠質瘤組織中存在高表達。
　　結論:HDAC6在膠質瘤組織中較正常腦組織中表達增高，提示HDAC6同樣可能在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著

15、重要作用。
　　第二章 HDAC6通過調控TGF-β/SMAD信號通路對惡性膠質瘤細胞的增殖過程產生影響
　　目的:探索TGF-β/SMAD信號傳導通路在HDAC6調控膠質瘤細胞增殖過程中的作用及機制。
　　方法:以惡性膠質瘤細胞系A-172、U87MG為研究對象，分別利用HDAC6抑制劑(ACY-1215)抑制HDAC6及SMAD2磷酸化的誘導劑（重組人TGFβ1）加入各實驗組中，實驗分組如下:陰性對照組（無任何干預

16、）、ACY-1215組（A-172、U87MG膠質瘤細胞中分別加入HDAC6抑制劑ACY-1215）、重組人TGFβ1組（A-172、U87MG膠質瘤細胞中分別加入重組人TGFβ1）;利用Western Blot檢測各實驗組A-172、U87MG惡性膠質瘤細胞中HDAC6、SMAD2、p-SMAD2、p21蛋白的表達情況;MTT增殖實驗檢測各實驗組A-172、U87MG惡性膠質瘤細胞的增殖能力，探討HDAC6能否通過激活TGF-β/SM

17、AD相關的信號通路來調控膠質瘤細胞的增殖能力。利用軟件SPSS16.0對實驗數據進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析;P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:實驗組加入HDAC6抑制劑ACY-1215后，Western blot實驗結果表明實驗組A-172、U87MG膠質瘤細胞中HDAC6蛋白的表達水平明顯下降，抑制劑ACY-1215能顯著提高SMAD2的磷酸化，以及提高后續(xù)的一種眾所周知的細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑

18、p21的表達量，重組人TGFβ1顯著誘導SMAD2的磷酸化并能顯著提高p21的含量，但并不影響HDAC6蛋白水平;同時，MTT增殖實驗結果表明抑制HDAC6后能顯著降低的膠質瘤細胞的增殖能力(P＜0.05)，重組人TGFβ1的干預作用可抑制惡性膠質瘤細胞的增殖能力(P＜0.05)。
　　結論:惡性膠質瘤細胞的增殖能力可被HDAC6抑制劑(ACY-1215)顯著抑制，HDAC6可通過抑制TGFβ/SMAD信號傳導通路來促進惡性膠質瘤