抑郁癥外周血單核細(xì)胞中差異性表達(dá)microRNA的臨床和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、抑郁癥是一種最為常見的精神疾病，在世界范圍內(nèi)，其終生患病率約為5.2％～19％。抑郁癥共病心血管疾病、心肌梗塞、糖尿病、物質(zhì)成癮等疾病的機(jī)會(huì)明顯高于正常人;此外，抑郁癥病人有著很高的自殺率，嚴(yán)重威脅人們的心身健康。此病不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)對(duì)其社會(huì)、職業(yè)功能造成明顯影響，使社會(huì)背負(fù)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至可成為社會(huì)不安定因素。盡管經(jīng)過數(shù)十年的努力，對(duì)于精神疾病包括抑郁癥的認(rèn)識(shí)有了很大的提高，但是對(duì)于抑郁癥的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物機(jī)制

2、尚不清楚。
　　已有研究表明，在抑郁癥的早期明確診斷并及時(shí)給予有效治療，可以顯著改善患者的心理、生理、社會(huì)功能以及工作效率，并大大減少治療費(fèi)用。然而，目前臨床上對(duì)于抑郁癥的診斷仍是依靠臨床醫(yī)生對(duì)病人多種癥狀的主觀評(píng)估，缺乏有效的客觀診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，因而在臨床上誤診、誤治在所難免。因此，臨床上迫切需要找到一種具有高度敏感性和特異性的生物標(biāo)志物，來幫助臨床醫(yī)生對(duì)抑郁癥做出早期診斷和早期干預(yù)。以往學(xué)者們對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌分

3、子、代謝產(chǎn)物以及腦影像學(xué)等因素進(jìn)行了大量研究，考察其作為生物標(biāo)志物的可行性，但是都未能達(dá)到生物標(biāo)志物所要求的特異度和敏感度。
　　microRNA是一類單鏈非編碼小分子RNA，長(zhǎng)約21-22個(gè)核苷酸，通過部分性或完全性地與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)互補(bǔ)配對(duì)，阻止其翻譯或使其降解，從而起到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。據(jù)研究，約有50％的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNA的精確調(diào)控，并且多個(gè)miRNA分子可以共同調(diào)節(jié)一個(gè)基因的表達(dá)，一

4、個(gè)miRNA分子亦可調(diào)控?cái)?shù)百、上千個(gè)基因的表達(dá)，使得miRNA成為調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。在大腦的發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟及突觸形成過程中，miRNA都起著關(guān)鍵的調(diào)控作用;在精神疾病的發(fā)生、發(fā)展中，miRNA亦起重要作用，其表達(dá)水平與抗精神病藥物的療效有相關(guān)性。已有研究表明miRNA通過多種途徑參與了抑郁癥發(fā)病機(jī)制:1.miRNA的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與抑郁癥之間存在顯著的相關(guān)性;2.miRNA通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生影

5、響抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展;3.miRNA參與神經(jīng)末稍突觸可塑性機(jī)制而影響抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展;4.應(yīng)激是抑郁癥發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，而急、慢性應(yīng)激會(huì)改變動(dòng)物模型腦內(nèi)miRNA的表達(dá);5.腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)與抑郁癥關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)BDNF可調(diào)節(jié)miR-132的表達(dá)，進(jìn)而引起神經(jīng)突形成增加及形成樹枝狀形態(tài);6.抗抑郁藥物可影響miRNA表達(dá)。
　　作為生物標(biāo)志物，必須有性質(zhì)穩(wěn)定、重復(fù)性好、便于采集和測(cè)量等特性。而外周血mi

6、RNA正好具備這些特征。其理化性質(zhì)穩(wěn)定，能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到?，由PCR定量檢驗(yàn)精度高且穩(wěn)定，其表達(dá)有組織特異性和時(shí)序性，而且采集方便、無創(chuàng)，費(fèi)用低廉，便于重復(fù)檢測(cè)動(dòng)態(tài)觀察其表達(dá)水平。更為重要的是，外周血白細(xì)胞與腦組織之間可能存在著相同的miRNA表達(dá)模式;此外，外周血淋巴細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜與其臨床癥狀之間存在密切的聯(lián)系，提示外周血淋巴細(xì)胞可能反映腦細(xì)胞的生理病理過程。上述種種特性啟發(fā)設(shè)想，外周血miRNA是否可以作為抑郁癥的生

7、物標(biāo)志物呢？檢索近年來的文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)在抑郁癥領(lǐng)域有類似的研究報(bào)道。
　　基于以上研究背景，設(shè)計(jì)如下課題來尋找、驗(yàn)證可以作為抑郁癥生物標(biāo)志物的外周血miRNA，并對(duì)相關(guān)miRNA在抑郁癥病理機(jī)制中所起的作用作出探討。課題分為下述四個(gè)部分。
　　第一部分:抑郁癥外周血單核細(xì)胞中差異性表達(dá)miRNA的篩選及驗(yàn)證
　　實(shí)驗(yàn)方法:采用Affymetrix miRNA3.0芯片對(duì)抑郁癥和對(duì)照者（各3例）的外周血miRNA樣本進(jìn)行

8、初步篩查，篩選出兩組間差異性表達(dá)的miRNA。然后選擇其中10個(gè)差異性表達(dá)的miRNA在91例抑郁癥和46例對(duì)照者的較大樣本中用qRT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。最后對(duì)經(jīng)過驗(yàn)證的顯著差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行ROC曲線分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過miRNA芯片分析，篩選出26個(gè)差異性表達(dá)的miRNA。其中21個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，5個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào);
　　2.選擇其中10個(gè)miRNA在擴(kuò)大樣本中采用qRT-PCR方法

9、進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-1972、miR-26b、miR-4485、miR-4498、miR-4743等5個(gè)miRNA的表達(dá)差異性具有顯著性。ROC曲線分析提示，上述5個(gè)miRNA作為一個(gè)整體，其聯(lián)合ROC曲線的AUC為0.6361，敏感值為54.35％，特異值為79.01％。
　　第二部分:抗抑郁藥物干預(yù)對(duì)PBMC中miRNA的影響
　　實(shí)驗(yàn)方法:采用5-羥色胺再攝取抑制劑（單藥或聯(lián)合用藥）對(duì)入組的27例抑郁癥病人實(shí)行藥物干

10、預(yù)。在藥物干預(yù)前及干預(yù)3周后，使用漢密爾頓抑郁量表(HAMD)24項(xiàng)版對(duì)病人的臨床癥狀進(jìn)行評(píng)估;同時(shí)抽取外周血，分離單核細(xì)胞后以qRT-PCR方法檢測(cè)miRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.抗抑郁藥物干預(yù)3周后，HAMD各項(xiàng)分?jǐn)?shù)除“日夜變化”因子外，總分及其它因子分均較治療前顯著下降;
　　2.在抗抑郁藥物干預(yù)3周后，患者PBMC中miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743

11、等5個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量均較治療前顯著上升，提示治療后各miRNA的表達(dá)水平均較治療前顯著下降;
　　3.將治療前后miRNA的△CT值之差(△△CT)取2的負(fù)對(duì)數(shù)，即2-△△CT與HAMD各分值之差（△值）作spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，miR-26b的2-△△CT值與△HAMD總分、△焦慮/軀體化因子分、△認(rèn)知障礙因子分呈顯著正相關(guān);miR-1972的2-△△CT值與△HAMD總分、△認(rèn)知障礙因子分呈顯著正相關(guān);mi

12、R-4743的2-△△CT值與△認(rèn)知障礙因子分呈顯著正相關(guān)。
　　第三部分:抑郁癥PBMC中差異性表達(dá)的miRNA的生物信息學(xué)分析
　　實(shí)驗(yàn)方法:采用TargetScan、miRDB、DIANA-microT-CDS等3個(gè)在線軟件分別對(duì)miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743等5個(gè)miRNA的靶基因做出預(yù)測(cè)，取3個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，作為miRNA的靶基因。繼而采用FunNet

13、軟件對(duì)5個(gè)miRNA的靶基因的合集進(jìn)行了Gene Ontology功能注釋和KEGG信號(hào)通路(Pathway)富集分析。
　　結(jié)果:
　　1.miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743的靶基因涉及廣泛的GO生物學(xué)過程，包括多項(xiàng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的條目;
　　2.靶基因所涉及的KEGG信號(hào)通路中許多與抑郁癥關(guān)系密切;
　　3.miR-26b、miR-1972、miR-44

14、98可能在抑郁癥的病理機(jī)制中起更加重要的作用。
　　第四部分:母嬰分離抑郁小鼠模型額葉皮層中miR-26b與mTOR信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)研究
　　實(shí)驗(yàn)方法:采用母嬰分離措施誘導(dǎo)小鼠抑郁模型，成年后以強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)來評(píng)估小鼠的抑郁行為。造模成功后，分別檢測(cè)6只母嬰分離小鼠和6只對(duì)照組小鼠額葉皮層中miR-26b的表達(dá)水平以及mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt的含量。再將miR-26b的表達(dá)水平分別與p-mTOR/mT

15、OR、p-Akt/Akt值作spearman相關(guān)分析。
　　結(jié)果:
　　1.母嬰分離組小鼠額葉皮層中p-mTOR/mTOR值和p-Akt/Akt值較對(duì)照組均顯著下降;
　　2.母嬰分離組小鼠額葉皮層中miR-26b的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高;
　　3.小鼠額葉皮層中miR-26b的相對(duì)表達(dá)量與p-mTOR/mTOR比值呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.抑郁癥病人PBMC中miR-26b、miR-197

16、2、miR-4485、miR-4498和miR-4743出現(xiàn)差異性表達(dá)，并且其變化水平與臨床癥狀相關(guān)，有希望作為抑郁癥的生物標(biāo)志物。
　　2.生物信息學(xué)分析提示，與抑郁癥相關(guān)的多條GO生物學(xué)過程和KEGG信號(hào)通路顯著富集;miR-26b、miR-1972、miR-4498可能在抑郁癥的病理機(jī)制中起著更為重要的作用
　　3.新生期母嬰分離可引起小鼠成年后額葉皮層中miR-26b表達(dá)顯著上調(diào)、mTOR信號(hào)通路活性顯著下降，且兩者