養(yǎng)殖鲆魚腹水病致病病原的分離、鑒定和診斷技術(shù)研究.pdf

1、腹水病是我國(guó)海水工廠化魚類養(yǎng)殖中流行范圍廣、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病。近年來，對(duì)各地爆發(fā)的養(yǎng)殖鲆魚腹水病流行病學(xué)調(diào)查和病原學(xué)研究結(jié)果表明，多種病菌均能導(dǎo)致腹水病的發(fā)生和流行，不同地區(qū)養(yǎng)殖鲆魚腹水病的致病病原不完全一致，主要有遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌等。這說明腹水病是一種綜合性病癥，它是被不同病原感染流行于不同地區(qū)的一種水生動(dòng)物疾病。腹水病的這一特征給該病的診斷和防治造成了困難。為了有針對(duì)性地開展診斷技術(shù)和免疫防治及綜合控制技術(shù)研究，作者對(duì)天津

2、地區(qū)養(yǎng)殖鲆魚腹水病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和致病病菌的分離和初步鑒定。經(jīng)回歸感染實(shí)驗(yàn)表明所分離的菌株FS1和菌株FS2為腹水病的原發(fā)病原菌。在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)兩株病原菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。主要的結(jié)果和結(jié)論如下： 1．從天津地區(qū)患腹水病的養(yǎng)殖鲆魚體內(nèi)分離到兩株病原菌，經(jīng)回歸感染實(shí)驗(yàn)確定這兩株病原菌為鲆魚腹水病的原發(fā)致病菌。 2．采用常規(guī)的生理生化鑒定方法及梅里埃全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(VITEK32)，結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行了

3、養(yǎng)殖鲆魚腹水病病原菌的鑒定。結(jié)果表明，菌株FS1和菌株FS2分別為遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS1 16SrRNA基因序列與遲緩愛德華氏菌的同源性達(dá)99％；菌株FS2的16SrRNA基因序列與溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均達(dá)99％。為最終確定菌株FS2的分類地位，測(cè)定了其HSF60基因序列，進(jìn)行網(wǎng)上同源性比對(duì)。分析結(jié)果表明菌株FS2與溶藻

4、弧菌的同源性達(dá)99％，而與其它弧菌HSP60基因的同源性均低于91％。這兩種致病菌混合感染或分別感染均可造成養(yǎng)殖鲆魚腹水病。 3．描述了用嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nested-PCR)分別檢測(cè)天津地區(qū)海水工廠化養(yǎng)殖大菱鲆和褐牙鲆腹水病病原菌遲緩愛德華氏菌(E.tarda)和溶藻弧菌(V. alginolyticus)的方法。以E78lF和E781R為引物，擴(kuò)增遲緩愛德華氏菌溶血素基因中781bp的片段，再以E485F和E485R為

5、引物，擴(kuò)增其中的485bp的片段；以V899F和V899R為引物，擴(kuò)增溶藻弧菌膠原酶基因中899bp片段，再以V550F和V550R為引物，擴(kuò)增其中的550bp片段。以其它常見海水魚類致病菌為陰性對(duì)照，結(jié)果均無非特異性擴(kuò)增。遲緩愛德華氏菌檢測(cè)方法的靈敏度為9.0× 10<'2>CFU/mL，溶藻弧菌檢測(cè)方法的靈敏度為4.1×10<'2>CFU/mL，對(duì)細(xì)菌DNA檢測(cè)靈敏度分別可達(dá)46fg和7.2fg。在此基礎(chǔ)上，以V899F、V

6、899R和E485F、E485R為引物組合，建立了可同時(shí)檢測(cè)遲緩愛德華氏菌和溶藻弧菌的double-PCR檢測(cè)方法。 4．用上述方法檢測(cè)海水工廠化養(yǎng)殖場(chǎng)中自然發(fā)病或外表健康的大菱鲆或褐牙鲆以及養(yǎng)殖水體的水樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可直接從魚體組織、養(yǎng)殖水體中準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出遲緩愛德華氏菌和(或)溶藻弧菌。 5．以上述所建立的檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，分別裝配出可檢測(cè)遲緩愛德華氏菌和溶藻弧菌的檢測(cè)試劑盒，并且已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專