人關節(jié)液對骨髓間充質干細胞定向分化影響的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的: 體外獲得人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymalstem cells,hBMSCs),并對獲取的hBMSCs進行純化、擴增及鑒定。通過人關節(jié)液與hBMSCs混合培養(yǎng),研究共培養(yǎng)系統(tǒng)導致hBMSCs定向誘導分化的影響,探討關節(jié)液對hBMSCs的作用,為以關節(jié)液和BMSCs作為軟骨組織工程基質的使用奠定一定的基礎。
   方法: 從因創(chuàng)傷導致不同部位的骨折需行骨折復位及髂骨植骨術的志愿者

2、中,獲取骨髓,采用全骨髓、貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)和分離hBMSCs。在實驗過程中,我們還對培養(yǎng)的hBMSCs進行了凍存和復蘇。實驗在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài);取生長狀態(tài)良好的P3代細胞進行表面標志物的表達和細胞表型的鑒定;取生長狀態(tài)良好的P1、P2、P3代細胞,分別用胰蛋白酶消化、培養(yǎng),以培養(yǎng)時間為橫軸,細胞數(shù)為縱軸,繪制hBMSCs生長曲線圖。在無菌操作下,患者取坐位,雙膝下垂,穿刺部位按常規(guī)進行皮膚消毒,用2%利多卡因作局部麻醉,于

3、健康志愿者的膝關節(jié)的髕骨下緣、髕韌帶外側1cm處,定位后用一次性10號注射針頭與脛骨平臺平行,向內呈45度角,穿刺進入,針頭完全刺入即可,抽取膝關節(jié)內的關節(jié)液,將其與生長良好的P3細胞混合用于實驗,將24孔板盲法隨機分為3組(A組、B組及C組),每組8孔,每個孔板內放置無菌并用多聚賴氨酸預處理過的爬片,其中:A組:單純關節(jié)液組(關節(jié)液+含體積分數(shù)10%FBS+1%雙抗的HG-DMEM);B組:關節(jié)液+hBMSCs組(關節(jié)液+hBMSCs

4、+含體積分數(shù)10%FBS+1%雙抗的HG-DMEM);C組:單純hBMSCs組(hBMSCs+含體積分數(shù)10%FBS+1%雙抗的HG-DMEM)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化和生長情況,分別于誘導后第7,14,21天行甲苯胺藍染色檢測酸性糖胺多糖表達,免疫組化染色檢測細胞Ⅱ型膠原表達。
   結果: 經全骨髓、貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)分離獲得了純度較高hBMSCs,細胞呈均一的長梭形、短梭形及多角形,漩渦狀或輻射狀結構,繪制的生長曲

5、線呈S形。所分離培養(yǎng)的細胞表達CD29、CD44、CD90、CD105分別為:99.6%、100%、99.4%、92.5%,呈均一、高表達性;而表達CD34、CD45分別為:0.5%、0.6%,呈低表達性。hBMSCs與關節(jié)液混合培養(yǎng)后,細胞增殖速度減慢,由長梭形變?yōu)槎嘟切巍E圓形,細胞外基質呈甲苯胺藍異染性陽性,Ⅱ型膠原免疫組化陽性,表現(xiàn)出向關節(jié)軟骨細胞分化的特點。
   結論: 全骨髓、貼壁培養(yǎng)法可成功分離hBMSCs,該方

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