B7-H1對胰腺癌細胞增殖能力影響和分子機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胰腺癌由于早期轉(zhuǎn)移、高侵襲性及缺少有效的治療措施,是一個高死亡率和短暫生存期的疾病。完全的腫瘤外科切除仍然是主要的有效治療措施,化療藥物對這一進展期疾病效果有限。當前研究致力于闡明胰腺癌的發(fā)病機理,探索早期診斷方法,尋找有治療價值的藥物靶點等。
  B7-H1(CD274,PD-L1)是在1999年首先發(fā)現(xiàn),屬于B7共刺激分子家族中的一種細胞表面糖蛋白。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)B7-H1在人類各系統(tǒng)腫瘤中廣泛分布,并與不良預(yù)后和腫瘤惡性程

2、度緊密相關(guān)。B7-H1蛋白的主要功能是參與腫瘤細胞對腫瘤抗原特異性T淋巴細胞的免疫逃逸過程,它可以與T細胞上的PD-1受體或其它受體結(jié)合從而誘導T細胞失活或凋亡、抑制T細胞增殖、抑制細胞因子如IL-2等的釋放,從而使腫瘤細胞免于受到T淋巴細胞的攻擊而得以存活。B7-H1在很多腫瘤組織中高表達,并與臨床分期病理分型相關(guān)。此外近年來的研究發(fā)現(xiàn)B7-H1分子不但介導對腫瘤細胞的免疫逃逸反應(yīng),而且在腫瘤中的異常表達會直接影響腫瘤細胞的生物學活性

3、。本課題擬重點研究B7-H1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制,探討B(tài)7-H1是否直接影響胰腺癌細胞的生物學活性,參與胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程,為臨床胰腺癌的分子靶向治療提供新的靶點。
  目的
  檢測B7-H1蛋白在胰腺導管腺癌標本中的表達。分別構(gòu)建B7-H1過表達和RNA干擾的慢病毒載體,研究B7-H1基因表達對人胰腺癌細胞增殖及遷移能力的影響。
  方法
  1.應(yīng)用免疫組化方法(IHC)測定30例胰腺導管

4、腺癌標本中B7-H1蛋白表達情況。
  2.PCR擴增B7-H1基因的完整開放閱讀框(open reading frame,ORF)片段,設(shè)計并合成針對B7-H1基因的RNAi靶向單鏈片段,通過慢病毒載體包裝系統(tǒng),對以上2種片段進行慢病毒顆粒包裝;再用病毒感染不同的胰腺癌細胞株,獲得穩(wěn)定高表達B7-H1蛋白(B7-H1-ORF)和B7-H1表達抑制(B7-H1-RNAi)的細胞株。
  3.體外細胞實驗:分別檢測不同細胞株的

5、生長曲線、細胞周期、克隆形成能力的變化,Western blotting法分析細胞周期相關(guān)蛋白及可能的信號分子變化,RT-PCR檢測B7-H1過表達細胞株上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因變化。
  采用SPSS17.0軟件單因素方差分析(ANVOA),實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,兩組之間的比較采用配對t檢驗。計數(shù)資料用x2檢驗及Spearman等級相關(guān)分析,P<0.05表示顯著差異,有統(tǒng)計學意義。
  結(jié)果<

6、br>  1.免疫組化分析顯示(62.4±9.1)%的胰腺導管腺癌標本中表達B7-H1蛋白,且主要定位于細胞質(zhì)。B7-H1蛋白在胰腺導管腺癌標本中表達高于胰腺正常組織。
  2.成功構(gòu)建B7-H1-ORF和B7-H1-RNAi慢病毒表達載體,并獲得穩(wěn)定高表達B7-H1的PANC-1細胞株和B7-H1表達抑制的BxPC-3細胞株。
  3.與對照組細胞相比,B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組細胞增殖速度和克隆形成能力均顯著加快,而B7-

7、H1-RNAi轉(zhuǎn)染組的細胞增殖速度和克隆形成能力顯著下降;細胞周期檢測進一步驗證了這一結(jié)果。B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組CDK4、CDK6、cyclinD1、p-Rb、p-JNK表達水平相比對照組有上調(diào),B7-H1-RNAi轉(zhuǎn)染組比對照組則出現(xiàn)下調(diào)。
  4.B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組細胞EMT相關(guān)基因檢測比對照組無明顯差異。
  結(jié)論
  B7-H1蛋白在胰腺導管腺癌標本中表達高于胰腺正常組織。提示B7-H1可能參與胰腺癌

8、發(fā)生發(fā)展的病理過程。體外實驗中,高表達B7-H1可以促進PANC-1細胞的增殖,而在B7-H1表達較高的BxPC-3細胞中降低B7-H1表達則抑制了細胞增殖。證明了B7-H1在胰腺癌中促進腫瘤發(fā)展的作用。并且這種影響可能是通過JNK通路調(diào)控的。B7-H1的過表達沒有引起胰腺癌細胞出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。本研究提示B7-H1的異常表達可能促進胰腺癌實體腫瘤的生長,B7-H1可能成為胰腺癌治療有效靶點,并為后續(xù)優(yōu)化針對B7-H1的臨床試驗提供理論基

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