MiR-221促進胰腺癌細胞自吞噬并靶向調控c-Fos抑制胰腺癌細胞侵襲轉移的分子機制研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種惡性程度極高、預后差的惡性腫瘤。其具有早期診斷率低，早期即發(fā)生原位及遠處轉移等特點.而胰腺癌細胞的高度侵襲和轉移特性是胰腺癌預后較差的重要原因之一。胰腺癌侵襲轉移的分子機制目前尚未完全闡明。為改善胰腺癌預后，針對胰腺癌的高度侵襲轉移特性，開發(fā)抑制胰腺癌侵襲轉移的特異性分子靶向治療方法，從而改善胰腺癌患者的預后，是亟待解決的主要問題。MicroRNA是一類由內源基因編碼的長度約為18-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，

2、作用于多種信使RNA(mRNA)，導致信使RNA的翻譯抑制或降解。越來越多的研究表明，microRNA可通過調節(jié)腫瘤細胞的侵襲，轉移，凋亡，增殖，自吞噬等，在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，診斷，預后和治療中扮演至關重要的作用。在前期研究中，我們利用倉鼠低侵襲株(PC-1)和移植后早期高頻率發(fā)生肝轉移的高侵襲株(PC-1.0)胰腺癌細胞，進行了microRNA的差異性表達比較研究。我們的前期研究證實，對比低侵襲性胰腺癌細胞，miR-221在高侵襲性胰

3、腺癌細胞中穩(wěn)定低表達。然而，miR-221是否作用于胰腺癌細胞的侵襲和轉移作用有待研究。本實驗的目的寄深入探討miR-221在胰腺癌侵襲和轉移中的作用，及其可能的分子機制。并探討miR-221是否可以調節(jié)胰腺癌細胞的自吞噬功能，以及其可能的作用機制。
　　方法：利用細胞形態(tài)學實驗，驗證過表達miR-221是否調控胰腺癌細胞的形態(tài)改變。利用Wound Healing遷移實驗，驗證過表達miR-221是否調控胰腺癌細胞的轉移功能。利用

4、Transwell侵襲實驗，驗證過表達miR-221是否調控胰腺癌細胞的侵襲功能。在前期研究中，通過生物學預測網站，我們預測c-Fos可能為miR-221調控的下游靶基因。本次試驗中，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實c-Fos是否為miR-221的直接調控的下游靶基因。并利用Western Blotting驗證miR-221對于c-Fos蛋白表達的調控作用。而后，利用Wound Healing遷移實驗，驗證抑制c-Fos蛋白表達是否調控胰腺

5、癌細胞的轉移功能。利用Transwell侵襲實驗，驗證驗證抑制c-Fos蛋白表達是否調控胰腺癌細胞的侵襲功能。并利用Western Blotting驗證c-Fos對金屬基質蛋白酶7（MMP-7）蛋白的表達的調控作用。從而揭示miR-221是否可以通過靶向調控c-Fos，調控胰腺癌細胞的侵襲與轉移功能。利用Western Blotting驗證過表達miR-221是否調控胰腺癌細胞的自吞噬功能。利用Western Blotting驗證過表達

6、miR-221是否調控組蛋白去乙?；?(HDAC6)蛋白表達。利用免疫熒光染色實驗，驗證抑制HDAC6蛋白表達是否調控胰腺癌細胞的自吞噬功能。從而闡述miR-221調控胰腺癌細胞自吞噬的可能機制。
　　結果：通常情況下，PC-1.0和AsPC-1細胞呈單細胞方式生長，然而，在上調miR-221的表達后，細胞生長方式由單細胞方式生長轉變?yōu)閸u樣克隆樣生長，miR-221可誘導細胞形態(tài)學變化。Wound Healing轉移實驗證實，在

7、上調miR-221的表達后，胰腺癌細胞轉移能力下調。同時，Transwell侵襲實驗證實，在上調miR-221的表達后，胰腺癌細胞侵襲能力明顯下調。表明miR-221可抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉移功能。雙熒光素酶報告實驗證實，c-Fos為miR-221的下游靶基因，并受miR-221反向調節(jié)。Western Blotting驗證了雙熒光素酶報告實驗的結果，上調miR-221的表達后，胰腺癌細胞中c-Fos蛋白的表達量明顯下調。Wound

8、Healing轉移實驗證實，在抑制c-Fos的表達后，胰腺癌細胞轉移能力下調。同時，Transwell侵襲實驗證實，在抑制c-Fos的表達后，胰腺癌細胞侵襲能力明顯下調。我們的實驗結果證實，下調c-Fos的表達后，胰腺癌細胞的侵襲和轉移能力明顯受到抑制。因此，miR-221對于胰腺癌細胞侵襲和轉移能力的調控可能是通過調控c-Fos的表達來實現(xiàn)的。與此同時，下調c-Fos表達可抑制MMP-7蛋白表達。證實了miR-221可能通過反向靶向調

9、節(jié)c-Fos，進而調節(jié)MMP-7蛋白表達，從而達到調控胰腺癌細胞侵襲和轉移的作用。Western Blotting實驗結果表明，過表達miR-221后，胰腺癌細胞LC3蛋白表達上調，miR-221可調控胰腺癌細胞的自吞噬功能。同時，Western Blotting實驗結果表明，過表達miR-221后，胰腺癌細胞HDAC6蛋白表達受到抑制。免疫熒光染色實驗證明，抑制胰腺癌細胞中HDAC6表達后，LC3在胰腺癌細胞胞質中的含量顯著上調。以上