DHPLC技術(shù)應(yīng)用于兩種常見出生缺陷的突變分析.pdf

1、所謂出生缺陷是指凡出生時就有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能的異?；虼x缺陷所致的異常。隨著現(xiàn)代醫(yī)學模式的改變,人類疾病譜和死亡譜發(fā)生了很大的變化,出生缺陷已逐漸成為我國圍生期嬰兒死亡的主要因為。根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的出生缺陷監(jiān)測結(jié)果,全國出生缺陷總發(fā)生率約為11‰,約8000萬殘疾人口中有70％是由出生缺陷所致。2004年田佩玲等對廣東省0～5歲兒童出生缺陷情況調(diào)查結(jié)果顯示,廣東地區(qū)最常見的出生缺陷為先天性心臟病,其次為地中海貧血。國內(nèi)大量研究表明,先

2、天性心臟病幾乎占據(jù)了主要出生缺陷疾病的1/3,是最常見的心臟病。該病是與環(huán)境因素相關(guān)的多基因遺傳病,其遺傳背景復雜,致病機制尚不明確。地中海貧血是最常見的單基因遺傳病之一,地理分布廣泛,人群攜帶率高,是嚴重危害人類健康的溶血性疾病。先天性心臟病和地中海貧血位列我國南方地區(qū)主要出生缺陷的前五位,已成為影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問題,給社會和家庭造成嚴重的經(jīng)濟和精神等方面的負擔。因此,建立行之有效的疾病篩查和診斷技術(shù)可及早

3、預(yù)防先天性心臟病和重癥地中海貧血的發(fā)生,以期降低此類疾病的發(fā)病率,對提高我國人口素質(zhì)具有重要意義。
　　 變性高效液相色譜(Denaturing High Performance Liquid Chromatography,DHPLC)技術(shù)已被證明是一種具有精確、高效、經(jīng)濟、高通量、半自動化等優(yōu)點的用于檢測已知突變及篩查未知突變的方法。其敏感性和特異性可達96％～100％,明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳(Denatured Gr

4、adient GelElectrophoresis,DGGE)、錯配化學切割分析(Chemical Cleavage of Mismatch,CCM)、構(gòu)象敏感性凝膠電泳(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis,CSGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-Strand Conformation Polymorphisms,SSCP)等變異檢測技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的突變篩查和分子

5、診斷中?；贒HPLC上述特點,本研究一方面試圖建立一種快速、準確、經(jīng)濟且適于中國人群常見非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病的基因分型技術(shù)；另一方面,擬進行中國南方地區(qū)單純性先天性心臟病易感基因突變的研究。
　　 第一章:基于PCR/DHPLC技術(shù)的中國人群非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知突變快速基因分型
　　 目的:非缺失型α-地中海貧血,α-異常血紅蛋白病以及具備非缺失型α-地中海貧血特征的異常

6、血紅蛋白病是一組由α-珠蛋白基因點突變引起的遺傳性溶血性血紅蛋白病,目前已發(fā)現(xiàn)至少300種突變與該病有關(guān)。本研究擬建立一種快速、準確、經(jīng)濟的適于中國人群非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知致病突變的基因分型技術(shù),使之可以應(yīng)用于相關(guān)疾病的研究、臨床診斷及大規(guī)模分子流行病學的人群篩查工作中。
　　 設(shè)計和方法:所有樣品均來自我國南方地貧高發(fā)區(qū),采用標準的飽和酚/氯仿法從外周血中提取基因組DNA。首先,收集本教研室已測通α-

7、珠蛋白基因全長的107例測序樣品作為群體研究資料分析α-珠蛋白基因上多態(tài)位點信息。其次,將33例包含10種致病突變和3種SNPs(來自群體資料)的樣品作為標準品,根據(jù)變異位點分布特征分別設(shè)計兩對擴增大片段(885bp和765bp)引物和兩對擴增小片段(295bp和277bp)引物,進行常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chainreaction,PCR),將標準品的PCR產(chǎn)物用于建立DHPLC檢測條件和與各種基因型對應(yīng)的標準DHP

8、LC圖譜。另選取已測序和/或由反向點雜交技術(shù)確診(ReverseDot-Blot,RDB)的171例包含各種基因型的樣品作為盲法對照的實驗對象,用于評價本方法的準確性。
　　 結(jié)果與討論:本研究通過33例標準品成功建立了非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知致病突變的PCR/DHPLC檢測體系和與由10種突變及3種SNPs組成的22種基因型對應(yīng)的標準DHPLC圖譜。盲法實驗中,171例由DHPLC方法檢測得出的結(jié)果與之前

9、檢測結(jié)果完全一致。
　　 本研究建立的基于PCR/DHPLC技術(shù)的非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知突變基因診斷方法是一種高通量、高靈敏度、自動化、快速、準確、經(jīng)濟的點突變檢測技術(shù)。該方法用于診斷中國人群常見非缺失型α-地貧,消除了目前廣泛應(yīng)用的RDB檢測方法中存在的假陽性及假陰性問題,并能用于非缺失型α-地貧未知突變的檢出。因此,該方法可適用于中國人群常見非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病的產(chǎn)前診斷和大規(guī)模

10、的分子流行病學調(diào)查研究。
　　 第二章:基于PCR/DHPLC技術(shù)的中國南方單純性先天性心臟病易感基因突變熱點研究
　　 目的:先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)是胎兒時期心血管發(fā)育異常而導致的先天畸形,在新生兒非感染性死亡中占首位。僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常,稱之為單純性先天性心臟病(non-syndromicCHD)。CHD是與環(huán)境相關(guān)的,某顯性主基因參與的多基因

11、遺傳性疾病,其遺傳因素在疾病發(fā)生過程中存在明顯的地區(qū)差異和種族差異。融合遺傳學、發(fā)育學和生物化學等方法的研究發(fā)現(xiàn),心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在CHD的分子基礎(chǔ)中占據(jù)核心地位,轉(zhuǎn)錄因子基因突變成為目前先天性心臟病發(fā)病機制研究的焦點。最早發(fā)現(xiàn)的心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5基因在國外人群共發(fā)現(xiàn)29種突變,突變率約4％。國內(nèi),Li T等在一個房間隔缺損家系中發(fā)現(xiàn)NKX2.5基因3個錯義突變,而散發(fā)型先心病中至今僅孫淼發(fā)現(xiàn)了一個三堿基缺失突變

12、。國外人群研究GATA4基因突變率僅為約2％,而中國漢族人群唐朝暉在31例患者中發(fā)現(xiàn)了兩個新的錯義突變,Weimin Zhang等在486例散發(fā)患者的12例不相關(guān)個體中發(fā)現(xiàn)9種新突變,包括一個小缺失突變、兩個小插入突變和六個錯義突變,提示中國漢族人群先天性心臟病患者轉(zhuǎn)錄因子基因突變檢測率及突變位點可能與國外人群不同。神經(jīng)嵴相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因TFAP2B與動脈導管未閉發(fā)病呈強關(guān)聯(lián),國外研究在Char氏綜合征家系及單純動脈導管未閉家系中發(fā)現(xiàn)8

13、種不同致病突變,而在中國人群未見報道。本課題擬研究GATA4、NKX2.5、TFAP2B基因在中國南方地區(qū)單純性先心病患者中的突變位點及分布情況,并進一步分析基因型與表型間的關(guān)系。
　　 方法:收集224例單純性先天性心臟病患者和121例健康個體的外周靜脈血采用標準飽和酚/氯仿方法抽提基因組DNA,利用PCR反應(yīng)以擴增GATA4、NKX2.5和TFAP2B基因的編碼序列為主,經(jīng)DHPLC技術(shù)直接對PCR產(chǎn)物進行檢測,出現(xiàn)異常峰型

14、的樣本再經(jīng)DNA測序驗證變異性質(zhì)。
　　 結(jié)果:1.GATA4基因中,在1例室間隔缺損病人發(fā)現(xiàn)一種新的錯義突變,編碼鏈第778位堿基C轉(zhuǎn)換為堿基G(c.788 C>G),導致263位密碼子由GCC轉(zhuǎn)換為GGC,編碼的氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)換為甘氨酸(p.Ala263Gly),位于GATA4蛋白高度保守的氨基端鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)；發(fā)現(xiàn)3種未經(jīng)報道的同義突變,分別為c.531C>A(GCC>GCA,p.Ala177Ala),c.1308C>T(

15、CAC>CAT,p.His435His)和c.1326G>A(GCG>GCA,p.Ala422Ala)。這些突變在對照組中均未檢測到。
　　 2.NKX2.5基因中未檢測到致病突變,僅發(fā)現(xiàn)三種已報道的SNPs:rs2277963(c.63A>G,GAA>GAG,p.Glu21Glu),rs3729753(c.606G>C,CTG>CTCp.Leu202Leu)和rs703752(c.975-61 G>T),基因型頻率及等位基因頻

16、率與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的中國人群攜帶率無顯著性差異。
　　 3.首次在中國散發(fā)單純性先天性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)2種新的TFAP2B基因突變。1例完全性心內(nèi)膜墊缺損患者攜帶c.31A>G(ATC>GTC,p.Ile11Val)錯義突變,正常人群中未檢測到該突變。病例組中另有6例表型不一的無關(guān)個體攜帶有同一種錯義突變c.1006 G>A(GTC>ATC,p.Val336Ile),在正常人群中也被檢測到,攜帶率為3/121。
　

17、　 結(jié)論:1.GATA4基因錯義突變c.788 C>G可能是中國南方人群室間隔缺損的發(fā)病因為之一。突變p.Ala263Gly使轉(zhuǎn)錄因子GATA4氨基端保守的鋅指結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變,干擾室間隔正常的發(fā)生與發(fā)育從而導致缺損的發(fā)生。GATA4基因可能在心臟間隔的正常發(fā)育中起著重要作用。2.中國南方單純性CHD患者中NKX2.5基因突變發(fā)生率極低,突變的發(fā)現(xiàn)可能限于某些家系或一些帶有特殊表型的個體中。NKX2.5基因?qū)ξ覈戏降貐^(qū)先心病的致病作用