內(nèi)皮祖細胞修復(fù)慢性脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：1.設(shè)計三種脊髓壓迫裝置，通過比較確定最佳裝置，為進一步研究慢性脊髓壓迫損傷的病理以及恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。2.從大鼠骨髓中分離出單個核細胞，使用誘導(dǎo)的培養(yǎng)基使其向內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化后，將其注入減壓模型以研究內(nèi)皮祖細胞在慢性脊髓壓迫模型減壓后對其恢復(fù)效果的影響。
　　方法：1.通過AutoCAD201064x與Solidworks201064x軟件設(shè)計并制作3種脊髓壓

2、迫固定裝置。取健康雄性Wistar大鼠29只編號后通過隨機數(shù)字生成器隨機分成實驗對照組(n=5)、簡單直板壓迫組(simple plate，SP組)(n=8)、彈性橋壓迫組(elastic bridge，EB組)(n=8)；抽屜尾翼鉤型壓迫組(drawer-hook，D-H組)(n=8)。實驗對照組只進行椎板切除術(shù)，實驗組分別植入3種壓迫裝置，植入一周后進行拉力拔出實驗，模型制成壓迫6周后進行TUNEL染色觀察細胞凋亡情況。2.取4-6

3、周齡Wistar大鼠(125-150g)雙股骨及脛骨骨髓，通過密度梯度離心法分離單個核細胞，使用內(nèi)皮系專用培養(yǎng)基EGM-2MV誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化為內(nèi)皮祖細胞。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的生長情況，通過流式細胞術(shù)其細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天測定細胞表面抗原CD133、CD34、KDR表達情況，并通過熒光供聚焦顯微鏡觀察細胞攝取Dil-acLDL與結(jié)合FITC-UEA-1能力，從功能學(xué)方面進一步鑒定誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞為血管內(nèi)皮祖細胞。3.15只已制作成

4、功的大鼠慢性脊髓壓迫模型壓迫6周后隨機分為模型對照組(n=5)、單純減壓組(n=5)和減壓聯(lián)合EPCs注射組(n=5)，進行BBB評分后進行減壓并拆除裝置。減壓聯(lián)合EPCs注射組減壓后立即給予細胞量為105的EPCs(10u)進行局部注射，單純減壓組給予PBS10u局部注射。觀察4周后在進行BBB評分，并且取脊髓標本進行ChAT熒光染色，進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：1.從X線觀察中3組裝置植入1周后SP與D-H無明顯脫位，EB組裝

5、置尾端向后脫位。拉力測定顯示在裝置拔出植入后樣本5mm范圍內(nèi)D-H拉力最大值為245.4±12.83，SP組和EB組分別為7.67±0.70和25.77±21.55對進行方差分析，組間有顯著差異(P<0.05)。D-H在拔出過程中出現(xiàn)拉力突越現(xiàn)象。壓迫6周后進行TUNEL染色顯示3組壓迫模型產(chǎn)生的陽性細胞數(shù)目均有顯著差異(P<0.05)。2.通過細胞形態(tài)變化的觀察、流式細胞術(shù)在培養(yǎng)第7天對表面抗原CD133，CD34和KDR的檢測，表達

6、分別為57.5％、11.4％和19.2％，和鑒定細胞功能的雙吞實驗證實本實驗分離和經(jīng)過EGM-2MV誘導(dǎo)培養(yǎng)所獲細胞為大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞。3.減壓4周后單純減壓組和減壓聯(lián)合EPCs注射組與減壓前BBB評分都較減壓時都有顯著差異(P<0.05)，兩組模型減壓4周后與減壓前BBB評分差異各有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。模型對照組的ChAT陽性細胞數(shù)目為4.4±1.67，單純給予減壓后4周ChAT陽性細胞數(shù)目為7.0±1.22，給予減壓聯(lián)合E