機(jī)械牽張對(duì)人肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome, ARDS）是由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭，由于缺乏特異有效的治療方法，其病死率仍然高達(dá)36％－44%。肺部進(jìn)行性纖維增殖的發(fā)生是影響ARDS患者搶救成功率及預(yù)后的主要因素。即便是幸存者，也會(huì)由于肺纖維化發(fā)生而遺留不同程度的肺功能損害和運(yùn)動(dòng)能力下降。因此，ARDS的肺纖維化進(jìn)程及其發(fā)生機(jī)制是ARDS研究的重要

2、方向。機(jī)械通氣是ARDS患者重要的治療手段之一，機(jī)械通氣給予患者重要生命支持的同時(shí)，不適當(dāng)?shù)臋C(jī)械通氣會(huì)引發(fā)或加重肺損傷。然而機(jī)械通氣對(duì)ARDS相關(guān)的纖維化發(fā)生的影響一直未被重視。過(guò)度的機(jī)械牽張會(huì)引起肺上皮損傷，持續(xù)的上皮損傷可以導(dǎo)致病理性修復(fù)甚至纖維化發(fā)生。同時(shí)越來(lái)越多研究表明肌成母纖維細(xì)胞作為調(diào)節(jié)肺纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵細(xì)胞，其主要激活方式是通過(guò)局部上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial to mesenchymal transition,EM

3、T）過(guò)程實(shí)現(xiàn)。因此本實(shí)驗(yàn)以人肺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)體外試驗(yàn)研究機(jī)械牽張對(duì)人肺上皮細(xì)胞EMT的影響及其可能機(jī)制，探討機(jī)械通氣在ARDS相關(guān)的肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的作用。
　　目的：研究不同條件的機(jī)械牽張對(duì)人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，從體外水平探討機(jī)械通氣在急性呼吸窘迫綜合癥相關(guān)肺纖維化中的作用及可能存在的機(jī)制。
　　方法：模擬氣管內(nèi)滴入鹽酸的ARDS動(dòng)物模型方法，牽張前對(duì)體外培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞用0.1

4、N HCl進(jìn)行預(yù)刺激（培養(yǎng)液PH=4.0）30min，同時(shí)用PBS處理作為對(duì)照。應(yīng)用FX-5000細(xì)胞牽張加載系統(tǒng)對(duì)處理后細(xì)胞施加不同條件的牽張刺激：10%，20%牽張應(yīng)力分別牽張24h，48h和72h，頻率0.33Hz。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；PBS+10%牽張組；PBS+20%牽張組；HCl組；HCl+10%牽張組；HCl+20%牽張組。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用RT-qPCR、Western blot和免疫熒光方法分別檢測(cè)E-c

5、adherin、Cytokeratin-8、α-SMA、Vimentin、TGF-β1、ACE2以及Midkine mRNA和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用Lipofectmine2000將Midkine siRNA轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞后施加20%牽張應(yīng)力48h，Westem blot觀察沉默Midkine表達(dá)對(duì)上述各指標(biāo)表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：⑴BEAS-2B細(xì)胞受到20%牽張48h及72h均可觀察到EMT改變，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)由鵝卵圓形變?yōu)?/p>

6、長(zhǎng)梭樣，細(xì)胞間隙明顯增寬；上皮標(biāo)志物E-cadherin，Cytokeratin-8表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，α-SMA，Vimentin及TGF-β1表達(dá)上調(diào)（p<0.05）；細(xì)胞予以10%牽張后其EMT相關(guān)指標(biāo)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵予以HCl預(yù)處理后行20%牽張?jiān)?4h時(shí)出現(xiàn)上述改變；予HCl預(yù)處理后行10%牽張，牽張72h后可觀察到EMT改變。⑶BEAS-2B細(xì)胞受到20%牽張48h后Midkine表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。⑷沉默Mid