EGCG對梗阻性腎病大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化調(diào)控機制的研究.pdf

1、腎臟纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路。本質(zhì)上，腎纖維化是以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度積聚和沉積為特征的過程，產(chǎn)生基質(zhì)(matrix)的細胞活化是腎纖維化形成的關(guān)鍵。當損傷及炎癥因素持續(xù)存在時，成纖維細胞(fibrosis)增殖并產(chǎn)生過量的細胞外基質(zhì)。此外，腎小球系膜細胞(mesangial cell)和腎小管上

2、皮細胞(renal tubularepithelial cell，RTEC)是主要的產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的細胞。腎纖維化早期，系膜細胞和纖維母細胞發(fā)生活化，腎纖維化晚期出現(xiàn)腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。有學者發(fā)現(xiàn)，RIF狀態(tài)下的成纖維細胞約36％來源于腎小管上皮細胞。近年來，腎小管EMT在腎纖維化中的作用日益受到重視。從器官纖維化發(fā)生機制入手，尋找有效的防治纖維

3、化的方法，是目前醫(yī)學研究的難點和熱點。TGF-β1是目前公認的最重要的促纖維化和EMT的細胞因子，因而通過抑制TGF-β1的產(chǎn)生或阻斷其生物活性來抑制EMT，被認為是抗腎纖維化的重要靶點。
　　腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機制之一是氧化應激(oxidative stress)，在輸尿管梗阻(ureteral obstruction)性腎病的腎間質(zhì)纖維化的動物模型中發(fā)現(xiàn)抗氧化能力下降;同時也有學者發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中，雖然不同的生長因子或細胞

4、因子引發(fā)各自的信號轉(zhuǎn)導及細胞反應，但他們的作用幾乎均通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)這條共同通路來完成，因這些因子可引起細胞內(nèi)ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，則阻斷了外界刺激引起的相應的信號轉(zhuǎn)導(Signal pathway)，使細胞增殖(proliferation)等功能受到抑制，因此理論上抗氧化劑對腎間質(zhì)纖維化有保護作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是強抗氧化劑，有研究發(fā)現(xiàn)EGCG有抗

5、肝臟和胰腺纖維化的作用，而對于腎臟纖維化和轉(zhuǎn)分化有無影響目前尚無報道。
　　本研究通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制作梗阻性腎病大鼠模型，觀察腎小管上皮細胞是否可以發(fā)生轉(zhuǎn)分化，并驗證EGCG對于腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化有無抑制作用;通過TGF-β1誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，探討腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的信號轉(zhuǎn)導途徑，并觀察EGCG對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用，為治療腎纖維化提供新的理論依據(jù)和方法。
　　實驗材料與方法:
　　

6、一、材料
　　Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為3組:正常對照組（N組），UUO模型組（以單側(cè)輸尿管結(jié)扎制作腎間質(zhì)纖維化模型），和EGCG治療組(該組在單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后每日給予腹腔注射EGCG5mg/kg)。在3天，7天和14天處死取材。
　　大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)，購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，由ATCC引進。將培養(yǎng)的細胞隨機分為四組:
　　1組:正常對

7、照組(N)，以DMEM培養(yǎng)液為空白對照。
　　2組:TGF-β1誘導組（培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml），
　　3組:EGCG200ug/ml干預組，培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml，EGCG濃度為200ug/L。
　　4組:EGCG400ug/ml干預組，培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml，EGCG濃度為400ug/L。
　　各細胞組在48小時收集細胞待測。同時1，2，3組進行細胞

8、爬片，48小時后多聚甲醛固定后待測。
　　二、方法
　　大鼠腎組織一部分經(jīng)4％的多聚甲醛固定后，用石蠟包埋，切片后用HE染色和Masson染色，觀察病理改變。
　　大鼠腎組織用免疫組化方法檢測α-SMA、CK-18、TGF-β1，Wstern-blot法檢測細胞核內(nèi)NF-κB的蛋白表達情況。
　　各組細胞用免疫組化方法檢測細胞爬片α-SMA、CK-18，采用Western-bloting方法檢測細胞漿中cycli

9、nD1，MMP9，Pi-Smad3，Pi-ERK，和細胞核中β-catenin的蛋白表達。各組細胞采用Realtime PCR檢測上述指標的mRNA的表達。
　　三、統(tǒng)計學分析
　　數(shù)據(jù)以均值±標準差（(x)±S）表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結(jié)果:
　　一、UUO組及EGCG治療組大鼠腎組織的病理變化
　　HE染色顯示，光鏡下正常對照組大鼠腎

10、臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密整齊，未見腎小管擴張、間質(zhì)炎性細胞浸潤及纖維增生等改變;UUO組第14天腎小管結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，可見腎小管萎縮，腎小管、集合管擴張呈囊狀，管腔塌陷，上皮細胞大量壞死，腎間質(zhì)彌漫性巨噬細胞、淋巴細胞浸潤和成纖維細胞增生。EGCG治療組14天上述改變較UUO組14天減輕。
　　Masson染色顯示，假手術(shù)組腎臟膠原染色主要位于小管基膜，UUO組14天膠原沉積明顯增多，腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)成分增

11、多，腎間質(zhì)纖維化程度明顯加重，腎間質(zhì)纖維組織相對面積較正常對照組明顯增大。EGCG治療組14天上述改變較UUO組14天減輕，腎間質(zhì)纖維組織相對面積較UUO組14天減少。
　　二、EGCG對UUO大鼠腎組織中CK-18、α-SMA，NF-κB和TGF-β1表達的影響
　　免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示:
　　CK-18的表達情況:正常對照組腎小管上皮細胞胞漿中高表達，UUO組7天表達明顯減少，14天減少更明顯

12、;而EGCG治療組CK-18減少的程度比UUO組輕。
　　α-SMA的表達情況:正常腎組織腎小管上皮細胞胞漿中幾乎不表達，UUO組7天和14天高表達，而EGCG治療組較UUO組表達減少。
　　NF-κB表達情況:正常腎組織細胞核內(nèi)微量表達，UUO組隨著時間延長，表達逐漸增多;而EGCG治療組各時間點較UUO組表達減少。
　　TGF-β1表達情況:正常組幾乎不表達，UUO組7天和14天在腎小管上皮細胞胞漿中高表達;EGC

13、G治療組各時間點均較UUO組減少。
　　三、EGCG對TGF-β1誘導的NRK細胞CK-18、α-SMA、cyclinD和MMP9表達的影響
　　免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示:
　　NRK細胞CK-18、α-SMA蛋白的表達情況:NRK細胞被TGF-β1誘導48小時后，胞漿中CK-18蛋白表達明顯減少，α-SMA蛋白出現(xiàn)了高表達;而NRK細胞被TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用48小時后，上述改變減輕。

14、>　　NRK細胞cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA的表達情況:NRK細胞被TGF-β1誘導48小時后，cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA表達明顯升高;而NRK細胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時比200ug/L能進一步減輕上述蛋白及mRNA的表達。
　　四、EGCG對TGF-β1誘導的NRK細胞Pi-Smad3，Pi-ERK1/2，β-catenin及其

15、mRNA的影響
　　Western-blot結(jié)果顯示:
　　NRK細胞漿中Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表達:NRK細胞被TGF-β1誘導48小時后，Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表達明顯升高;而NRK細胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時比200ug/L能進一步減輕上述蛋白及mRNA的表達。
　　NRK細胞漿中Pi-ERK1/2蛋白及ERK2

16、 mRNA表達:NRK細胞被TGF-β1誘導48小時后，Pi-ERK1/2蛋白及ERK2 mRNA表達明顯升高;而NRK細胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時比200ug/L能進一步減輕上述蛋白及mRNA的表達
　　NRK細胞核中β-catenin蛋白及其mRNA的表達:TGF-β1誘導組β-catenin蛋白較正常組表達明顯升高，EGCG干預組表達少于TGF-β1誘導組，并

17、且EGCG濃度400ug/L比200ug/L時減少更明顯;TGF-β1誘導組β-catenin的mRNA的表達較正常組減少，EGCG干預組較TGF-β1誘導組表達增多，但仍少于正常組。
　　結(jié)論:
　　1、UUO大鼠存在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，EGCG能通過減少TGF-β1的表達和減少NF-κB的活化，維持腎小管上皮細胞表型，減輕腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。
　　2、在體外實驗，EGCG以劑量依賴方式抑制MMP9、cyclin